在Saccharomyces cerevisiae中，CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白被整合到布尔逻辑门的体系中。这些新型的小型逻辑电路表现出良好的性能，加深了对基于dCas9/dCas12a的转录因子以及抗CRISPR蛋白特性的理解。
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方法文章
基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
合成基因布尔门与数字电路在医学诊断到环境护理等多个领域具有广泛应用。CRISPR-Cas 系统及其天然抑制因子——抗 CRISPR 蛋白（Acrs）的发现，为设计和实现 体内 基因数字电路。本文描述了一种遵循“设计-构建-测试-学习”生物工程循环理念的实验方案，该方案利用dCas9/dCas12a及其相应的Acr蛋白，在细胞内构建小型转录调控网络，其中部分网络可表现出布尔逻辑门的行为， 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）这些结果揭示了dCas9/dCas12a作为转录因子的特性。具体而言，为实现基因表达的最大程度激活，dSpCas9需要与一种经过工程改造的支架RNA相互作用，该RNA可募集多个VP64激活结构域（AD）拷贝；相比之下，dCas12a则需在其C末端融合强效的VP64-p65-Rta（VPR）激活结构域。此外，增加细胞内sgRNA/crRNA的量并不能增强这两种Cas蛋白的活性。本文还阐述了如何基于CRISPR-dCas-Acr相互作用构建布尔逻辑门。其中，与人雌激素受体激素结合结构域融合的AcrIIA4是响应β-雌二醇的非门（NOT gate）的核心元件，而由可诱导系统合成的AcrVA蛋白则用于其他逻辑门的设计。 GAL1 启动子能够以半乳糖作为输入，模拟YES和NOT逻辑门。在后一类电路中，AcrVA5与dLbCas12a共同表现出最佳的逻辑行为。
引言
2011年，研究人员提出了一种计算方法，并开发了相应的软件，用于自动设计数字合成基因回路1用户需指定输入端数量（三个或四个），并填写电路的真值表；这提供了利用电子学技术推导电路结构所需的全部信息。真值表被转化为两个布尔表达式 通过 卡诺图法2每个布尔公式由子句构成，这些子句描述了电路输入及其否定（即文字）之间部分或全部的逻辑运算（加法或乘法）。子句本身则通过相加（OR）或相乘（AND）来计算电路输出。任何电路均可根据其对应的两种公式之一实现：一种为积之和（POS，product of sums）形式，另一种为和之积（SOP，sum of products）表示。前者由多个子句（即布尔门）相乘构成，每个子句包含文字的逻辑加；后者则相反，是由多个子句相加而成，每个子句中的文字先进行逻辑乘。
通过在面包板上将不同的门电路进行物理连接，可以实现电子电路。电流允许门电路之间交换信号，从而计算出输出结果。
在生物学中，情况更为复杂。布尔门可以通过转录单元（TU；即真核细胞内“启动子-编码区-终止子”序列）来实现，其中转录或翻译（或两者）受到调控。因此，至少有两种分子构成了生物线路：转录因子蛋白和非编码的反义RNA1。
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方案
1. sgRNA/crRNA 表达盒的设计与构建
注意：sgRNA/crRNA 表达盒有两种类型：一种称为 SNR5210，由依赖于 RNA 聚合酶 III 的 SNR52 启动子、sgRNA/crRNA 序列以及 SUP4 终止子组成；另一种简称为 RGR11，由依赖于 RNA 聚合酶 II 的 ADH1 启动子、包含两个核酶（锤头状核酶-HH 和乙型肝炎 delta 病毒核酶-HDV）及位于其间的 sgRNA/crRNA 序列所组成的 RGR（核酶-向导 RNA-核酶）结构，以及 ADH1 终止子构成。引导 Cas9 同源蛋白的 sgRNA 由间隔序列和特征性的直接重复序列12 组成，而用于 Cas12a 蛋白的 crRNA 则由直接重复序列后接间隔序列构成13,14（本研究中使用的所有 DNA 序列见补充表 1）。
- 设计用于Cas9/Cas12a介导的转录激活的间隔序列。
- 利用细菌 lex 操纵子序列（称为 lexOp）作为靶位....
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结果
由RNA聚合酶III型启动子驱动的sgRNA/crRNA表达
首先，本研究针对转录激活回路（回路1）的构建进行了研究，如图所示 图1A包含三个基本组分：1）编码yEGFP（报告基因）的基因，其上游连接一系列不同的合成启动子，这些启动子提供dCas9/dCas12a-AD的靶向位点；2）经酵母密码子优化的dCas9或dCas12a，分别与激活结构域（VP64和VPR）融合，并含有一段或两段核定位序列（NLSs）；两种dCas蛋白均由强组成型启动子pGPD驱动表达；3）引导dCas9/dCas12a-AD靶向至目标位点的sgRNA/crRNA序列。基于dCas9/dCas12a的激活系统的激活效率通过报告基因的荧光强度（测定）进行可视化和反映 通过 FACS 实验。
测试了一种dCas9蛋白（dSpCas9）和两种dCas12a蛋白（denAsCas12a和dLbCas12a）。当dSpCas9在其C末端延伸并融合VP64激活结构域（AD），且结合于合成启动子上游时，.......
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讨论
本方案展示了一种合成基因数字电路的完整工作流程，遵循"设计-构建-测试-学习"（DBTL）生物工程循环，并涵盖干实验与湿实验两方面。本文重点研究CRISPR-Cas系统，主要包括dSpCas9、denAsCas12a、dLbCas12a以及相应的抗CRISPR蛋白，通过在S. cerevisiae中设计和构建小型转录调控网络来实现。其中部分网络模拟了布尔逻辑门，即数字电路的基本组成单元。本文所描述的所有电路均有助于揭示CRISPR相关蛋白及抗CRISPR蛋白在S. cerevisiae中的特性与功能。这些结果对于将上述蛋白纳入基因数字电路体系具有重要意义。
DBTL 概念为合成生物学提供了一个框架，但在测试新构建物后还需进行大量优化和改进。例如，在电路1中，最初合成启动子上游的 yEGFP 仅含有一个靶位点（一个 lexOp 拷贝），供 dCas9/dCas12a-AD 结合。在测试该电路构型后，我们发现其激活效果不超过两倍15,
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢天津大学合成生物学实验室（SPST）所有学生的一般性帮助，同时感谢李志和张向阳在FACS实验中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 mL PCR 8联管 | NEST | 403112 | |
| 0.2 mL PCR管 | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 15 mL 离心管 | BIOFIL | CFT011150 | |
| 2 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-200-C | |
| 50 mL 离心管 | BIOFIL | CFT011500 | |
| 琼脂糖（分子生物学级） | Invitrogen | 75510-019 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Solarbio | 69-52-3 | |
| Applied Biosystems Veriti 96孔梯度PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | |
| AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 | Axygen | AP-GX-250 | |
| BD FACSuite CS&T 研究用荧光微球 | BD | 650621 | 荧光微球 |
| BD FACSVerse 流式细胞仪 | BD | - | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| Sorvall ST 16R 离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| E. coli 感受态细胞（DH5α菌株） | Life Technologies | 18263-012 | |
| ECL Select 蛋白印迹检测试剂 | GE Healthcare | RPN2235 | |
| 电泳仪 | 北京君意电泳设备有限公司 | JY300C | |
| 平盖8联管盖 | NEST | 406012 | |
| 基因合成公司 | Azenta Life Sciences | https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗 Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | |
| HiFiScript cDNA合成试剂盒 | CWBIO | CW2569M | 步骤6.2.2.1中使用的试剂盒 |
| 裂解液（Zymolyase） | zymoresearch | E1004-A | |
| Nikon Eclipse 80i 荧光显微镜 | Nikon | - | 荧光显微镜 |
| 移液器吸头—10 μL | Axygen | T-300-R-S | |
| 移液器吸头—1000 μL | Axygen | T-1000-B-R-S | |
| 移液器吸头—200 μL | Axygen | T-200-Y-R-S | |
| pRSII403 | Addgene | 35436 | |
| pRSII404 | Addgene | 35438 | |
| pRSII405 | Addgene | 35440 | |
| pRSII406 | Addgene | 35442 | |
| pRSII424 | Addgene | 35466 | |
| pTPGI_dSpCas9_VP64 | Addgene | 49013 | |
| Q5 高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0491 | |
| 限制性内切酶-Acc65I | New England Biolabs | R0599 | |
| 限制性内切酶-BamHI | New England Biolabs | R0136 | |
| 限制性内切酶-SacI-HF | New England Biolabs | R3156 | |
| 限制性内切酶-XhoI | New England Biolabs | R0146 | |
| Roche LightCycler 96 | Roche | - | 实时荧光定量PCR仪 |
| S. cerevisiae CEN.PK2-1C | - | - | 亲本菌株，基因型为：MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2 |
| Stem-Loop 试剂盒 | SparkJade | AG0502 | 步骤6.2.1.3中使用的试剂盒 |
| T100 梯度PCR仪 | BIO-RAD | 186-1096 | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202 | |
| T5 核酸外切酶 | New England Biolabs | M0363 | |
| Taq DNA连接酶 | New England Biolabs | M0208 | |
| Taq DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0495 | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x)（SYBR Green I染料） | Takara | RR820Q | |
| YeaStar RNA提取试剂盒 | Zymo Research | R1002 | |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E8875 |
参考文献
- Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).
- Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the Ameri....
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