利用加热块测定浮游动物的热耐受极限

摘要

本方案介绍了利用市售组件产生稳定且线性温度梯度的方法。该温度梯度可用于测定浮游生物（尤其是无脊椎动物幼虫）的最高耐热极限。

摘要

温度耐受极限和耐受范围被广泛用于预测物种分布。随着全球气温持续上升，了解温度耐受极限如何随驯化而变化，以及其在不同生活阶段和种群间的差异，对于评估物种在未来变暖环境下的脆弱性至关重要。大多数海洋生物具有复杂的生活史，包含早期浮游阶段。尽管量化这些微小早期发育阶段（数十至数百微米）的温度耐受极限有助于识别发育瓶颈，但由于目标生物体积极小、实验台空间需求大以及初始制作成本高，这一过程可能具有挑战性。本文介绍了一种适用于小体积（毫升至数十毫升）样品的实验装置。该装置结合多种市售组件，可产生稳定且线性的温度梯度。同时提供了该装置的制作规格，以及引入样本、区分并计数存活与死亡个体、计算致死温度的操作步骤。

引言

耐热性对生物体的生存和功能至关重要^1,2。由于人类活动导致的碳排放持续引起地球变暖，人们对热耐受极限的测定及其应用日益关注³。已有多种终点指标被用于确定生物的上限和下限热耐受极限，例如死亡、发育失败以及运动能力丧失等⁴。这些热耐受极限通常被用作生物体热生态位的替代指标。该信息进而可用于识别对全球变暖更为脆弱的物种，并预测未来物种的分布格局及其相互作用关系^3,5,6,7。然而，确定热耐受极限，特别是对于小型浮游生物而言，仍具有挑战性。

对于浮游生物，特别是海洋无脊椎动物的幼虫阶段，其热耐受极限可通过长期暴露实验来确定。长期暴露实验通过在数天至数周内将幼虫在多个不同温度下培养，并确定导致幼虫存活率和/或发育速率下降的温度来实现^8,9,10

方案

1. 加热块的制备

1. 将120 V、100 W的条状加热器连接至变阻器（参见 材料表).
2. 通过在铝块上钻出60个呈6×10网格排列的孔洞（见 材料表）。确保孔与孔之间在两个方向上的中心间距为 2 cm，每个孔的直径为 1.1 cm，深度为 4.2 cm（图1).
   注意：在铣床或钻床上使用高速钢钻头进行钻孔。加热元件和冷却元件均被选择为尽可能覆盖15.2 cm × 5 cm接触表面的大部分区域。
3. 在其中一个20.3 cm × 5 cm的表面上，于1之间再钻两个孔^st 和 2^nd 柱和9^th 和 10^th 柱，尺寸与温度控制器探头相匹配（参见 材料表).
4. 使用1.2厘米（0.5英寸）透明亚克力板构建一个外壳（参见 材料表）以固定各部件并为完成的加热块提供绝缘。使用两层丙烯酸材料对加热元件的背面进行绝缘（图1).
5. 在最终组装时，涂抹导热硅脂（参见 材料表以最大化加热元件向金属块以及金属块向冷却元件的热传导。
....

结果

本实验方案的目的是确定浮游动物的最高耐热极限。为此，需要建立一个稳定且线性的温度梯度。通过将水浴温度设定为 8 °C、加热器设定为 39 °C，该装置可产生 14 °C 至 40 °C 的温度梯度（图 2A）。通过调整两端温度值，可缩小或移动该温度梯度范围。例如，将加热器设定为 37 °C、水浴设定为 15 °C 时，也可建立一个范围较窄的温度梯度（19 °C 至 37 °C）。装置搭建后 45 分钟至 1 小时内，温度模块中的温度即可达到稳定（图 2B）。

为了说明本方案在浮游动物中的应用，研究了沙钱（Dendraster excentricus）幼虫在个体发育过程中上临界温度耐受性（以LT₅₀表示）的变化。 gravid沙钱从商业渠道获得（见材料表）。通过注射0.5–1 mL的0.35 M氯化钾诱导配子释放。收集的卵用0.45 µm过滤海水经63 µm尼龙筛网冲洗。精子以干燥方式收集并置.......

讨论

本方案通过急性热暴露，提供了一种简便且可定制的方法，用于测定小型浮游生物的热耐受极限。该装置采用10孔设计，低温端由水浴控制，高温端由加热器控制，具有灵活的温度终点设置，可精确测定LT₅₀。使用该方法可检测到小于<1 °C的热耐受差异（图3）。该方法可在数小时内快速测定多种物种的热耐受极限，所得数据已应用于多个物种分布模型^2,21。然而需要注意的是，与慢性暴露相比，急性暴露所获得的热耐受估值可能存在差异^8,26。

当前设计的一个主要优势是，在较小的空间（20.3 cm × 15.2 cm × 5 cm）内即可实现10个温度处理和6个重复。以往采用类似热梯度方法测定热耐受极限的研究使用了更大的铝制导热条（例如，文献²⁷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 膜过滤器	VWR	74300-042
½” 丙烯酸板	McMaster-Carr	8560K266	用于构建具有足够隔热性能的刚性外壳。
1 mL 注射器	VWR	76290-420
双通道 7 型热电偶数据记录仪	Omega Engineering	HH506A	可用任何可放入微型离心管的温度计替代
自动移液器	Ranin
带 430 不锈钢护套的螺栓和夹具安装条形加热器 120V 交流，1-1/2" 宽，100W	McMaster-Carr	3619K32
Crystal Sea 生物测定混合物	Pentair	CM2B	用于配制人工海水
Denraster excentricus	M-Rep		来自加利福尼亚的沙钱
解剖显微镜	Nikon	SMZ645
DIYhz 铝制水冷块，适用于 PC 计算机 CPU 图形散热器的液态水冷却散热系统，吸热头银色（40 mm x 120 mm x 12 mm）	Amazon		连接至水浴，用于冷却模块的一端。
易加工 MIC6 铸造铝板，厚度 2"，尺寸 8" x 8"	McMaster-Carr	86825K953	加工成 2" x 6" x 8"，带有 60 个等距孔（直径 11 mm，深度 42 mm），并在一侧额外钻两个孔用于恒温探头。
经济型柔性聚乙烯泡沫管绝缘材料	McMaster-Carr	4530K121	覆盖在冷却器与模块之间的塑料管上，以减少热量损失。若温度范围接近室温，可省略
EVERSECU 72w 110-240v 水族箱水冷加热/冷却温度控制器，适用于鱼虾缸、海洋珊瑚礁缸，适用于 20 L/30 L 以下水族箱冷却器	Amazon		可替代实验室级水浴
以幼体沙钱为例
GENNEL 100 g 银色硅胶导热硅脂，适用于 GPU、CPU、IC、LED、烤箱冷却	Amazon		提高模块与加热和冷却元件之间的热传导效率。
Inkbird WiFi 爬行动物恒温控制器，带两个探头和两个输出口，IPT-2CH 爬行动物加热垫恒温器（每输出口最大 250 W）	Amazon		监测热端和冷端，维持热端在设定范围内
Lauda Ecoline Silver 风冷式制冷循环器	VWR	89202-386	可用 aquarium chiller 替代
微型离心管	VWR	76019-014	若使用较大的动物，可选用扫描瓶（VWR 66022-004）作为替代方案
Nitex 网格滤膜	自制		使用热熔胶将 Nitex 网格固定在 1/2" PVC 管上
巴斯德移液管	VWR	14673-010
氯化钾（0.35 M）	Millpore-Sigma	P3911-500G
R 统计软件	The R Project for Statistical Computing
注射器针头	VWR	89219-346	根据目标生物的大小，可选用 14 号或 16 号规格的针头
Tygon 管	McMaster-Carr	5233K65	可根据所用冷却器和模块调整尺寸
Zoo Med Repti Temp 可变电阻恒温器	Chewy.com		额定功率 150 W，已重新布线以直接向加热元件供电，用于控制热量输出速率