Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64889

⸱

17 februari 2023

 ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2Genetics Graduate Program, Stony Brook University

In dit artikel

Samenvatting

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.

Samenvatting

Borstkanker is een complexe ziekte die is ingedeeld in verschillende histologische en moleculaire subtypen. Patiënt-afgeleide borsttumor organoïden ontwikkeld in ons laboratorium bestaan uit een mix van meerdere tumor-afgeleide celpopulaties, en vertegenwoordigen dus een betere benadering van tumorceldiversiteit en -milieu dan de gevestigde 2D-kankercellijnen. Organoïden dienen als een ideaal in vitro model, waardoor cel-extracellulaire matrixinteracties mogelijk zijn, waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in cel-celinteracties en kankerprogressie. Patiënt-afgeleide organoïden hebben ook voordelen ten opzichte van muismodellen omdat ze van menselijke oorsprong zijn. Bovendien is aangetoond dat ze de genomische, transcriptomische en metabole heterogeniteit van patiënttumoren samenvatten; Ze zijn dus in staat om tumorcomplexiteit en patiëntendiversiteit weer te geven. Als gevolg hiervan zijn ze klaar om nauwkeuriger inzicht te bieden in de ontdekking en validatie van doelen en gevoeligheidstests voor geneesmiddelen. In dit protocol geven we een gedetailleerde demonstratie van hoe patiënt-afgeleide borstorganoïden worden vastgesteld uit gereseceerde borsttumoren (kankerorganoïden) of reductief mammoplastiek-afgeleid borstweefsel (normale organoïden). Dit wordt gevolgd door een uitgebreid verslag van 3D-organoïdecultuur, expansie, passaging, bevriezing en ontdooiing van van de patiënt afgeleide borstorganoïde culturen.

Inleiding

Borstkanker (BC) is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen, met naar schatting 287.850 nieuwe gevallen die in 2022 in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd1. Ondanks de recente vooruitgang in vroege detectie met jaarlijkse screenings, gerichte therapieën en een beter begrip van genetische aanleg, is het de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen in de Verenigde Staten, met > 40.000 sterfgevallen toegeschreven aan borstkankerper jaar 1. Borstkanker wordt momenteel ingedeeld in meerdere subtypen op basis van histopathologische en moleculaire evaluatie van de primaire tumor. Betere subtypestratificatie heeft de patiëntresultaten verbeterd met subtypespecifieke behandelingsopties2. De identificatie van HER2 als een proto-oncogen3 heeft bijvoorbeeld geleid tot de ontwikkeling van Trastuzumab, waardoor dit zeer agressieve subtype bij de meeste patiënten beheersbaar is geworden4. Verder onderzoek naar de genetica en transcriptomica van deze complexe ziekte op een patiëntspecifieke manier zal helpen bij het ontwikkelen en voorspellen van betere patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsregimes 2,5. Patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) zijn een veelbelovend nieuw model om inzicht te krijgen in kanker op moleculair niveau, nieuwe doelen of biomarkers te identificeren en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwerpen 6,7,8.

BOB's zijn meercellige, driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van vers gereseceerde primaire weefselmonsters 8,9. Ze worden driedimensionaal gekweekt door ingebed te zijn in een hydrogelmatrix, meestal samengesteld uit een combinatie van extracellulaire matrix (ECM) -eiwitten, en kunnen daarom worden gebruikt om tumorcel-ECM-interacties te bestuderen. BOB's vertegenwoordigen de diversiteit van de patiënt en recapituleren cellulaire heterogeniteit en genetische kenmerken van de tumor10,11,12. Omdat het in vitro modellen zijn, maken ze genetische manipulatie en high-throughput medicijnscreeningsmogelijk 13,14,15. Verder kunnen BOB's plausibel worden gebruikt om de gevoeligheid en behandelingsstrategieën van patiënten parallel aan de kliniek te evalueren en de uitkomsten van de patiënt te helpen voorspellen16,17,18. Naast chemotherapie zijn bepaalde organoïde modellen ook gebruikt om individuele reacties van patiënten op chemoradiatiete onderzoeken 19,20. Gezien de veelbelovende toepasbaarheid van BOB's voor onderzoek en klinisch gebruik, heeft het National Cancer Institute een internationaal consortium geïnitieerd, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, om deze van tumoren afgeleide nieuwe kankermodellen te genereren en te leveren. Veel van de organoïde modellen van verschillende soorten kanker ontwikkeld via de HCMI zijn beschikbaar via de American Type Culture Collection (ATCC)22.

Van normale borstorganoïden is aangetoond dat ze bestaan uit verschillende epitheelcelpopulaties die aanwezig zijn in de borstklier 11,23 en dienen dus als geweldige modellen om fundamentele biologische processen te bestuderen, om drivermutaties te analyseren die tumorigenese veroorzaken, en voor kankercel-van-oorsprong afstammingsstudies 6,15 . Borsttumor organoïde modellen zijn gebruikt om nieuwe doelen te identificeren die de vooruitzichten voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën aanmoedigen, met name voor resistente tumoren24,25,26. Met behulp van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en gematchte PDX-afgeleide organoïde (PDxO) modellen van behandelingsresistente borsttumoren, toonden Guillen et al. aan dat organoïden krachtige modellen zijn voor precisiegeneeskunde, die kunnen worden gebruikt om medicijnresponsen en directe therapiebeslissingen parallel te evalueren28. Bovendien biedt de ontwikkeling van nieuwe co-cultuurmethoden voor het kweken van BOB's met verschillende immuuncellen27,28,29, fibroblasten 30,31 en microben 32,33 een kans om de impact van de tumormicro-omgeving op kankerprogressie te bestuderen. Hoewel veel van dergelijke co-cultuurmethoden actief worden vastgesteld voor BOB's die zijn afgeleid van pancreas- of colorectale tumoren, zijn vergelijkbare gevestigde co-cultuurmethoden voor borst-BOB's alleen gemeld voor natural killer-cellen34 en fibroblasten35.

De eerste biobank van >100 patiënt-afgeleide organoïden die verschillende borstkankersubtypes vertegenwoordigen, werd ontwikkeld door de Hans Clevers-groep36,37. Als onderdeel van deze inspanning ontwikkelde de Clevers-groep ook het eerste complexe kweekmedium voor borstorganoïdegroei, dat momenteel veel wordt gebruikt36. Een vervolgstudie leverde een uitgebreid verslag op van de oprichting en kweek van borst-BOB's en van patiënten afgeleide organoïde xenografts (PDOXs)38. Het Welm-lab ontwikkelde een grote verzameling BC PDX-modellen en PDxO's die worden gekweekt in een relatief eenvoudiger groeimedium met foetaal runderserum (FBS) en minder groeifactoren39,40. We hebben onafhankelijk een groot aantal naïeve patiënt-afgeleide borstkanker organoïde modellen11 ontwikkeld en gekarakteriseerd en hebben deelgenomen aan de ontwikkeling van BC PDO-modellen als onderdeel van het HCMI-initiatief21. Hier willen we een praktische gids bieden met details over de methodologie die door ons wordt gebruikt bij het genereren van patiënt-afgeleide borstorganoïde modelsystemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Tumorresecties van borstkankerpatiënten, samen met het distale en aangrenzende normale weefsel, werden verkregen van Northwell Health in overeenstemming met de protocollen IRB-03-012 en IRB 20-0150 van de Institutional Review Board en met schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten.

OPMERKING: Alle onderstaande procedures werden uitgevoerd in een BSL2-kamer voor weefselkweek bij zoogdieren die was aangewezen voor patiëntmonsters na goedkeuring van het bioveiligheidscomité. Alle procedures moeten worden uitgevoerd volgens veiligheidsprotocollen die aseptische omstandigheden in bioveiligheidskasten handhaven. Elke centrifugatiestap wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT), tenzij anders vermeld. Weefsel/organoïden en keldermembraanmatrixvoorraden worden altijd op ijs geplaatst, tenzij anders vermeld. Nieuwe platen worden 's nachts geïncubeerd voor voorverwarming. Het plateren van koepels op voorverwarmde platen zorgt voor de beste resultaten om afgeronde koepels te verkrijgen die niet afvlakken tijdens het plateren of later optillen van het plaatoppervlak.

1. Medium bereiding en recepten

  1. Bereid R-spondin1 geconditioneerde media voor zoals hieronder beschreven (alternatief kan commercieel worden gekocht).
    1. Bereid twee afzonderlijke groeimedia voor die zijn samengesteld uit Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), 10% FBS, 5% penicilline-streptomycine en met of zonder 300 μg / ml zeocine-suppletie.
    2. Ontdooi een injectieflacon met HEK293T-HA-Rspondin1-Fc-cellen (verkregen uit het laboratorium van Calvin Kuo aan de Stanford University en ook in de handel verkrijgbaar) in een weefselkweekkolf van 75 cm2 met 15 ml medium.
    3. Splits de cellen in 2 x 175 cm2 kweekkolven, elk met 35 ml medium dat zeocin bevat.
    4. Passeer de cellen opnieuw om zoveel kolven te verkrijgen als nodig is voor het genereren van de gewenste partij R-spondin1 geconditioneerd medium. Gebruik groeimedium zonder zeocin.
    5. Wanneer de kolven met medium zonder zeocine samenvloeien, verwijdert u het groeimedium en vervangt u het door Ad-DF+++ (stap 1.2; Tabel 1). Plaats de cellen gedurende 1 week in een 37 °C incubator met 5% CO2 .
    6. Draai het medium gedurende 5 minuten op 400 x g om eventuele niet-vastgemaakte cellen te verwijderen. Filtreer het medium door een filter van 0,22 μm. Maak 25 ml aliquots en bewaar ze bij -20 °C (kan maximaal 6 maanden worden bewaard).
    7. Voer met behulp van HEK293T-cellen een dubbele luciferase TOPFLASH41,42-test uit met behulp van een commercieel DNA-transfectiereagens met een 4,8: 1-reagens tot DNA-verhouding met het verdunningsmiddel DMEM (hoog glucose, pyruvaat). Voeg 100 μL R-spondin1 geconditioneerd medium (of basaal medium voor de negatieve controle) toe aan 100 μL getransfecteerde cellen. Voer vervolgens de dubbele luciferasetest uit volgens het protocol van de fabrikant om de Wnt-activiteit van het R-spondin1-geconditioneerde medium te verifiëren.
      OPMERKING: De test maakt gebruik van een TOP-plasmide met Firefly luciferase-activiteitsuitlezing en het FOP-plasmide wordt gebruikt als een negatieve controle.
  2. Bereid basaal medium (Ad-DF+++ medium, zoals eerder gepubliceerd door Sachs et al.36).
    ReagensVoorraadconcentratieEindconcentratie
    Geavanceerde DMEM/F121x1x
    GlutaMax100x1x
    HEPES1 m10 mM
    Penicilline-Streptomycine10.000 U/ml; 10.000 μg/ml100 U/ml; 100 μg/ml

    Tabel 1: Basale Ad-DF+++ medium samenstelling.
  3. Bereid een compleet medium voor voor van de patiënt afgeleide borstorganoïden zoals eerder gepubliceerd door Sachs et al.36.
    ReagensVoorraadconcentratieEindconcentratie
    Ad-DF+++ medium1x1x
    R-spondin in eigen beheer100%10%
    B-27 supplement50x1x
    Nicotinamide1 m5 mM
    NAC500 mM1,25 mM
    Primocine50 mg/ml50 μg/ml
    Noggin100 μg/ml100 ng/ml
    Menselijk EFG5 μg/ml5 ng/ml
    Menselijke Heregulin β1/Neuregulin175 μg/ml37,5 ng/ml
    Y-27632 Dihydrochloride (Rho-Kinase)100 mM5 μM
    A83-015 mM500 nM
    Menselijke FGF-7100 μg/ml5 ng/ml
    Menselijke FGF-101 mg/ml20 ng/ml
    p38i30 mM498 nM

    Tabel 2: Volledige mediumsamenstelling voor van de patiënt afgeleide borstorganoïden.
  4. Bereid 2 mg/ml collagenase IV-oplossing door de vereiste hoeveelheid collagenase IV-poeder te wegen en op te lossen in Ad-DF+++ basaal medium. Filter voor gebruik door een filter van 0,22 μm.
  5. Bereid 0,5% runderserumalbumine (BSA)-oplossing uit 7,5% stockoplossing met 1x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) als verdunningsmiddel. Filter voor gebruik door een filter van 0,22 μm.

2. Vaststellen van borsttumor/normale organoïden uit gereseceerd weefsel (figuur 1)

  1. Transporteer een chirurgisch gereseceerd borsttumor / normaal weefselmonster naar het laboratorium in een conische buis van 50 ml met Ad-DF +++. Bewaar de buis op ijs tot het begin van de isolatie.
  2. Ontdooi een fles keldermembraanmatrix op ijs of een nacht bij 4 °C.
  3. Breng het gereseceerde weefsel over in een steriele petrischaal van 10 cm. Onderzoek het weefsel macroscopisch en noteer of het morfologisch vet, gevasculariseerd of necrotisch lijkt. Noteer bovendien de grootte en vorm van het weefsel. Maak idealiter een foto van het weefsel met een liniaal in het zicht (figuur 2).
  4. Hak het weefsel in zeer kleine stukjes (~ 1 mm3) met een steriel nr. 10 scalpel en breng het over in een conische buis van 50 ml.
  5. Voeg 10 ml collagenase IV-oplossing van 2 mg / ml toe en sluit de buis af met een transparante film. Plaats de buis op een orbitale shaker bij 37 °C bij 140 tpm gedurende 30-90 minuten in een schuine positie (~ 30 ° hoek).
  6. Plaats tijdens de incubatie een hoeveelheid volledig medium om voor te verwarmen in een kraal/waterbad van 37 °C.
  7. Resuspendeer het weefsel elke 15 minuten door krachtig op en neer te mengen met behulp van een steriele serologische pipet van 5 ml. Bedek de pipet vooraf met 0,5% BSA-oplossing om weefselverlies te voorkomen dat wordt veroorzaakt doordat het monster aan de pipet blijft plakken. Controleer de dissociatie in de loop van de tijd door de conische buis onder de microscoop te observeren bij een vergroting van 5x of hoger.
  8. Zodra het weefsel is gedissocieerd, centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant op, voeg 10 ml Ad-DF+++ toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g .
  9. Gooi het supernatant voorzichtig weg. Weefselkorrels kunnen af en toe los zitten, dus wees voorzichtig bij het aanzuigen. Herhaal de stap nogmaals.
  10. Als de weefselkorrel gedeeltelijk rood is, voeg dan 2 ml rode bloedcellysisbuffer toe en incuber gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer niet langer, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk zal verminderen.
  11. Voeg 10 ml Ad-DF+++ toe aan de buis, centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 50-300 μL onverdunde, koude keldermembraanmatrix en meng door voorzichtig te pipetteren om te voorkomen dat er bellen ontstaan.
    OPMERKING: Het volume van de toegevoegde keldermembraanmatrix is afhankelijk van de pelletgrootte. Als u het niet zeker weet, plaatst u een kleine koepel van ~ 10 μL van de geresuspendeerde pellet en observeert u de samenvloeiing onder de microscoop. Pas aan door indien nodig meer keldermembraanmatrix toe te voegen. Zie figuur 3 (afbeelding van dag 1) voor een referentiezaaidichtheid.
  12. Plaat 300 μL van keldermembraanmatrixkoepel met organoïden in elke put van een voorverwarmde, gelabelde, 6-well weefselkweekplaat. Raadpleeg tabel 3 voor de aanbevolen keldermembraanmatrix en middelgrote volumes bij gebruik van verschillende platen.
    Aantal putten per plaatKeldermembraanmatrix per koepel (μL)Medium per put (μL)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (ophanging in plaats van koepel)100

    Tabel 3: Hoeveelheid keldermembraanmatrix en groeimedium aanbevolen per put op basis van plaatgrootte.
  13. Laat de plaat 5 minuten ongestoord in de kap en plaats deze vervolgens voorzichtig gedurende 20-30 minuten in de incubator bij 37 °C zodat de keldermembraanmatrixkoepel volledig stolt.
  14. Voeg 3 ml voorverwarmd compleet medium druppelsgewijs toe aan elke put van een 6-putplaat en plaats in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Maak foto's van de organoïden met behulp van een 5x objectief op een omgekeerde brightfield microscoop.
  15. Vul het medium elke 4-8 dagen aan op basis van de groei van organoïden. Zuig het oude medium voorzichtig op zonder de koepel te verstoren en voeg vers, voorverwarmd medium druppelsgewijs toe.
    OPMERKING: Het protocol is hetzelfde voor het vaststellen van borstkankerorganoïden afgeleid van de gereseceerde tumor en voor normale organoïden afgeleid van gereseceerd gezond borstweefsel (hetzij van aangrenzend en normaal borstweefsel van dezelfde patiënt of gezond borstweefsel verkregen van een reductieve mammoplastiechirurgie).

3. Het passeren en uitbreiden van patiënt-afgeleide borstorganoïden in cultuur

  1. Ontdooi een fles keldermembraanmatrix op ijs of een nacht bij 4 °C.
  2. Til de keldermembraanmatrixkoepel in het medium in de put met behulp van een celschraper of een pipetpunt van 1 ml.
  3. Coat de pipetpunt voor met 0,5% BSA-oplossing en breng vervolgens de drijvende koepel van de organoïden met medium over naar een conische buis van 15 ml of 50 ml, afhankelijk van het aantal putten dat wordt geoogst. Gebruik voor meer dan twee putten met 300 μL keldermembraanmatrixkoepels een conische buis van 50 ml. Voeg 1x DPBS toe om het volume te verhogen tot ten minste 5 ml.
  4. Draai de buizen op 400 x g gedurende 5 min. De keldermembraanmatrix met organoïden vormt onderaan een laag. Voorzichtig opzuigen om het supernatant te verwijderen.
  5. Voeg 5-20 ml 1x DPBS toe, afhankelijk van het aantal putten dat in een buis is gepoold. Coat een steriele wegwerppipet voor met 0,5% BSA en meng de organoïde-keldermembraanmatrixpellet in DPBS gelijkmatig door op en neer te pipetteren.
  6. Draai de buizen op 400 x g gedurende 5 min. Zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg.
  7. Voeg celdissociatiereagens met driemaal het volume van de keldermembraanmatrix toe aan de buis. Gebruik een 0,5% BSA-gecoate pipetpunt om de organoïden in het celdissociatiereagens te resuspenderen.
  8. Plaats de buis op een orbitale shaker bij 37 °C bij 140 tpm gedurende 8-15 minuten in een schuine positie. Controleer de buis door deze elke 5 minuten onder de microscoop te observeren om ervoor te zorgen dat de organoïden worden afgebroken in kleinere clusters.
  9. Voeg basaal medium (d.w.z. Ad-DF+++) toe met een volume gelijk aan of groter dan het celdissociatiereagens en pipet om de organoïden te mengen. Draai op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT om een organoïde pellet te verkrijgen.
  10. Als de pellet organoïden bevat die nog steeds zijn ingebed in de onopgeloste keldermembraanmatrix, herhaalt u stap 3.7-3.9 voor nog eens 5-8 minuten trypsinisatie.
  11. Zodra een witte organoïde pellet zonder onopgeloste keldermembraanmatrix is verkregen, gooit u het supernatant weg en voegt u 1 ml Ad-DF +++ toe om de pellet te resuspenderen door pipetteren. Voeg vervolgens meer Ad-DF +++ toe tot 10 ml.
  12. Draai op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT voor de wasstap. Zuig het supernatant op en gooi het weg.
  13. Voeg de vereiste hoeveelheid keldermembraanmatrix toe aan de verteerde organoïden op basis van de juiste splitverhouding (dit zal sterk variëren voor elke organoïdelijn op basis van de groeisnelheid). Zie figuur 3 (afbeelding van dag 1) voor een voorbeeld van de zaaidichtheid. Meng door zachtjes op en neer te pipetteren om te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Onmiddellijk op ijs plaatsen.
  14. Open en label een voorverwarmde 6-well plaat. Het wordt aanbevolen om een koepel van 10-20 μL in de hoek van een put te plaatsen om de samenvloeiing onder de microscoop te observeren. Als de organoïden confluent zijn, kan meer keldermembraanmatrix worden toegevoegd om de splitverhouding te verhogen.
  15. Plaat 300 μL koepels van organoïden geresuspendeerd in keldermembraanmatrix. Zorg ervoor dat u de buis op ijs houdt tijdens het bekleden van meerdere putten, zodat de keldermembraanmatrix in oplossing blijft.
  16. Laat de plaat 5 minuten ongestoord in de kap en plaats deze vervolgens voorzichtig in een 37 °C incubator met 5% CO2 zonder de koepels te verstoren.
  17. Na 20-30 min stollen de koepels. Voeg 3 ml voorverwarmd compleet medium toe aan elke put en plaats de plaat terug in de couveuse. Voeg elke 5-7 dagen vers medium toe. Voer routinetests uit van de culturen voor het detecteren van mycoplasmabesmetting.
    OPMERKING: Het protocol voor de kweek van borsttumoren en normale organoïden is hetzelfde. In onze ervaring hebben normale organoïden echter de neiging om goed te groeien tot passage 6-8 voordat ze vertragen. Het is raadzaam om zoveel mogelijk vroege passagebestanden te maken voor toekomstig onderzoek.

4. Bevriezen van de patiënt afgeleide borstorganoïden

  1. Doorgang confluente putten van organoïden om elke keldermembraanmatrix te verwijderen, zoals vermeld in stappen 3.1-3.12.
  2. Resuspensie van de pellet van organoïden in celvriesmedium ('s nachts ontdooid bij 4 ºC) met 1 ml medium per 200-300 μL keldermembraanmatrixvolume voordat het passeert. Voer een celtelling uit voordat u bevriest ter referentie. Aliquoteer een klein volume (ten minste 100 μL) cellen om verdere trypsinisatie te ondergaan, indien nodig, om afzonderlijke cellen te krijgen en tel ze vervolgens met behulp van een celtellermachine.
  3. Breng 1 ml cellen over in 2 ml cryovialen gelabeld met organoïde lijnnummer, datum en passagenummer. Zorg ervoor dat u de buizen labelt met een permanente marker of gebruik cryolabels.
  4. Verplaats de injectieflacons naar een celvriescontainer en breng de container over naar een vriezer van -80 °C. Na incubatie 's nachts zijn de injectieflacons klaar om te worden verplaatst naar een vriezer voor opslag met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

5. Ontdooien van de patiënt afgeleide borstorganoïden

  1. Ontdooi een fles keldermembraanmatrix op ijs of een nacht bij 4 °C. Verwarm Ad-DF+++ medium voor op 37 °C. Aliquot 9 ml voorverwarmd medium in 15 ml conische buisjes voor elke bevroren injectieflacon.
  2. Ontdooi de bevroren injectieflacon met organoïden snel door deze in een kralenbad van 37 °C te plaatsen. Spuit 70% ethanol en breng de buis over in de bioveiligheidskast.
  3. Spoel de pipetpunt af met 0,5% BSA-oplossing om organoïdeverlies te voorkomen. Meng de ontdooide organoïden voorzichtig door op en neer te pipetteren om eventuele bezonken organoïden in de buis te mengen.
  4. Breng 1 ml bevroren organoïden voorzichtig druppelsgewijs over op 9 ml voorverwarmde Ad-DF+++. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 400 x g en gooi het supernatant vervolgens voorzichtig weg.
  5. Was de pellet door 10 ml vers voorverwarmd Ad-DF+++ toe te voegen aan de organoïde pellet en meng voorzichtig met een pipet die is voorbedekt met 0,5% BSA om de pellet te resuspenderen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 400 x g en gooi het supernatant voorzichtig weg.
  6. Plaats de organoïde pellet op ijs en verwijder eventuele restanten Ad-DF+++ voorzichtig met behulp van een pipetpunt met een kleiner volume. Resuspendeer de pellet in 300 μL keldermembraanmatrix en plaat in een voorverwarmde 6-putplaat. Plaats de plaat in een 37 °C incubator met 5% CO2.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een kleine koepel van 10 μL van de geresuspendeerde pellet in een hoek van de put te plaatsen om de samenvloeiing onder de microscoop te onderscheiden. Als de organoïden er confluent uitzien, verdun dan door 300 μL keldermembraanmatrix toe te voegen aan de plaat in twee putten van een 6-putplaat.
  7. Voeg na een incubatie van 20-30 minuten 3 ml voorverwarmd medium toe aan de gestolde koepel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben een biobank opgezet van patiënt-afgeleide borsttumor organoïden bestaande uit verschillende subtypes11. Daarnaast hebben we meerdere normale borstorganoïde lijnen vastgesteld die zijn afgeleid van reductieve mammoplastiekweefselmonsters of aangrenzende / distale normale borst van BC-patiënten met behulp van de aanpak die is beschreven in figuur 1.

De verschillende van de patiënt afgeleide organoïde lijnen van borsttumoren verschil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ons laboratorium heeft met succes de bovenstaande protocollen gebruikt om organoïden vast te stellen uit naïeve tumorresecties of schaafwonden. We hebben dit protocol ook gebruikt om normale organoïden te ontwikkelen uit borstweefsel verkregen via reductieve mammoplastieën of uit aangrenzend of distaal normaal borstweefsel van kankerpatiënten. Ongeveer 30%-40% van de gereseceerde primaire tumoren resulteerde in succesvolle langdurige (>passage 8) tumor organoïde culturen. De tumororganoïde lijnen die na een paar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

We willen de leden van het Spector-lab bedanken voor de kritische discussies in de loop van dit werk. We bedanken Norman Sachs en Hans Clevers (Hubrecht Instituut, Nederland) voor het in eerste instantie verstrekken van hun organoïde kweekprotocol. We erkennen de CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources voor diensten en technische expertise (NCI 2P3OCA45508). Wij danken Dr. Qing Gao voor zijn hulp bij de voorbereiding van histologische monsters. We zijn dankbaar voor de steun van Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) voor het verstrekken van tumormonsters van patiënten. We waarderen ook de inspanningen van het Northwell Health Biobanking-team voor monsterverwerving en we bedanken de patiënten en hun families voor het doneren van weefsels voor onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), en Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson en D.L.S).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL conische buisjesVWR525-1068
175 cm2 weefselkweekflesVWR (Corning)29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conische buisjesVWR525-1077
50 mL vacuümfiltratiesysteem (0.22 µm Filter)Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membraan, 75 mm diameterNalgene566-0020
6-well kweekplaten Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 weefselkweekflesVWR (Corning)29185-304
96-well matte platenCorning353296Voor CTG-assay
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementLife Technologies12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate ReaderFisher Scientific (Agilent)Voor dual luciferase-assay en CTG-assay
BSA fraction V (7.5%)Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG) ReagentPromegaG9683luminescent celviabiliteitsassay
Centrifuge Eppendorf5804
Collageenase uit Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Type IV
CryolabelsAmazonDTCR-1000Direct Thermal Cryo-Tags, Wit, 1.05 x 0.5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Countess 3 Geautomatiseerde CeltellerThermo FisherAMQAX2000
DMEM, hoge glucose, pyruvaatThermo Fisher (Gibco)11995040
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)Gibco14190-144DPBS
Epidermale groeifactor (hEGF)PeprotechAF-100-15
Fetaal bovien serum (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (menselijk)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (menselijk)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies35050061
HEK293T cellenATCCCRL-3216 Voor TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cellenR&D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cellen
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (menselijk)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL eiwitconcentratie)Corning356231Fenol-rood vrij, LDEV-vrij; basement membraan matrix
Mr. Frosty CelbevriezingscontainerThermo Fisher5100-0001
Mycoplasma detectiekitLonzaLT07-418
N-acetyl-l-cysteïneMillipore SigmaA9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Wegwerpfiltereenheden met PES-membranenThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (menselijk)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipetten met tips
p38 MAPK remmer (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmtransparante film
Penicilline-StreptomycineLife Technologies15140122
Plasmid1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 µmpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher (Gibco)12648-010celbevriezingsmedium
Rode Bloedcel Lysis BufferMillipore Sigma11814389001
R-spondin geconditioneerde mediaIn-house of commercieel van Peprotech120-38
Schaar (Nr.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β receptor remmer A 83-01Tocris2939
Trypan Blauw Kleur (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzym (1X), fenol roodLife Technologies12605028celdissociatie reagens
X-tremeGENE 9 DNA transfectiereagensMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001

Referenties

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178(1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233(2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574(2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
  22. Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380(2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388(2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232(2022).
  40. PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396(2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Patiëntafgeleide organoïdenorganoïdecultuurtumororganoïdenbasaalmembraanmatrixweefseldissociatie3D-celkweekpasseren van organoïdengeneeskundige gevoeligheidsassaycelviabiliteitsassay
Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.