Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.
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Methodenartikel
Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adulte mesenchymale Zellen haben in den letzten Jahrzehnten die Molekular- und Zellbiologie revolutioniert. Sie können sich in verschiedene spezialisierte Zelltypen differenzieren, zusätzlich zu ihrer großen Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Migration und Proliferation. Fettgewebe ist eine der am wenigsten invasiven und am leichtesten zugänglichen Quellen für mesenchymale Zellen. Es wurde auch berichtet, dass es im Vergleich zu anderen Quellen höhere Erträge sowie überlegene immunmodulatorische Eigenschaften aufweist. In jüngster Zeit wurden verschiedene Verfahren zur Gewinnung adulter mesenchymaler Zellen aus verschiedenen Gewebequellen und Tierarten veröffentlicht. Nachdem wir die Kriterien einiger Autoren ausgewertet hatten, haben wir eine Methodik standardisiert, die für verschiedene Zwecke anwendbar und leicht reproduzierbar ist. Ein Pool von stromaler vaskulärer Fraktion (SVF) aus perirenalem und epididymalem Fettgewebe ermöglichte es uns, Primärkulturen mit optimaler Morphologie und Funktionalität zu entwickeln. Es wurde beobachtet, dass die Zellen 24 h lang an der plastischen Oberfläche hafteten und eine fibroblastenähnliche Morphologie mit Verlängerungen und einer Tendenz zur Bildung von Kolonien aufwiesen. Mittels Durchflusszytometrie (FC) und Immunfluoreszenz (IF) wurde die Expression der Membranmarker CD105, CD9, CD63, CD31 und CD34 untersucht. Die Fähigkeit von Fettstammzellen (ASCs), sich in die adipogene Linie zu differenzieren, wurde ebenfalls anhand eines Cocktails von Faktoren (4 μM Insulin, 0,5 mM 3-Methyl-iso-butyl-xanthin und 1 μM Dexamethason) bewertet. Nach 48 Stunden wurde ein allmählicher Verlust der Fibroblastoid-Morphologie beobachtet, und nach 12 Tagen wurde das Vorhandensein von Lipidtröpfchen bestätigt, die positiv für eine ölrote Färbung waren. Zusammenfassend wird ein Verfahren vorgeschlagen, um optimale und funktionelle ASC-Kulturen für die Anwendung in der regenerativen Medizin zu erhalten.
Einleitung
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben die regenerative Medizin aufgrund ihrer hohen Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Proliferation, Migration und Differenzierung in verschiedene Zelllinien stark beeinflusst 1,2. Derzeit konzentriert sich ein großer Teil der Forschung auf ihr Potenzial für die Behandlung und Diagnose verschiedener Krankheiten.
Es gibt verschiedene Quellen für mesenchymale Zellen: Knochenmark, Skelettmuskulatur, Fruchtwasser, Haarfollikel, Plazenta und Fettgewebe, um nur einige zu nennen. Sie werden von verschiedenen Spezies gewonnen, darunter Menschen, Mäuse, Ratten, ....
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Protokoll
Alle Versuchsverfahren wurden nach den mexikanischen Richtlinien für die Tierhaltung durchgeführt, basierend auf den Empfehlungen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexiko). Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Gesundheitsforschung des Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) geprüft, genehmigt und registriert.
1. Entfernung von Fettgewebe bei Ratten durch chirurgische Resektion
- Bereiten Sie zwei konische Röhrchen mit 20 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösungs-Antibiotika-Antimykotikum....
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Ergebnisse
Fettgewebe wurde von adulten Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 3-4 Monaten und einem Körpergewicht von 401 ± 41 g (geometrisches Mittel ± SD) gewonnen. Ein Mittelwert von 3,8 g Nebenhoden- und perirenalem Fettgewebe entsprach der Analyse von 15 experimentellen Extraktionen. Nach 24 h Kultur blieben die Zellpopulationen an der plastischen Oberfläche haften und wiesen eine heterogene Morphologie auf. Die erste Passage wurde nach 8 ± 2 Tagen mit einer Ausbeute von 1,4 ± 0,6 x 106 Zellen in insgesamt acht Experim.......
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Diskussion
In den letzten vier Jahrzehnten seit der Entdeckung von MSCs haben mehrere Forschergruppen Verfahren zur Gewinnung von MSCs aus verschiedenen Geweben und Spezies beschrieben. Einer der Vorteile der Verwendung von Ratten als Tiermodell ist ihre einfache Pflege und schnelle Entwicklung sowie die einfache Gewinnung von MSCs aus Fettgewebe. Für die Gewinnung von ASCs wurden verschiedene Gewebequellen beschrieben, wie z. B. viszerales, perirenales, Nebenhoden- und subkutanes Fett 12,13,14,15,16.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Die Autoren danken dem mexikanischen Institut für soziale Sicherheit (IMSS) und dem mexikanischen Kinderkrankenhaus, Federico Gomez (HIMFG) und den Bioterio-Mitarbeitern der IMSS-Forschungskoordination für die Unterstützung bei der Durchführung dieses Projekts. Wir danken dem Nationalen Rat für Wissenschaft und Technologie für das AOC-Stipendium (815290) und Antonio Duarte Reyes für die technische Unterstützung bei der Erstellung des audiovisuellen Materials.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analysenwaage | Sartorius | AX224 | |
| Antikörper anti-CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antikörper anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antikörper anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antikörper anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antikörper Anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antikörper Ziege anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antikörper Esel Anti-IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antikörper Anti-Maus IgG FITC konjugierte Ziege F (ab&akut;) | RD-Systeme. | Nr. F103B | |
| Flaschenaufsatzfilter Steril | CORNING | 10718003 | |
| Zell- und Gewebekulturflaschen | BIOFIL | 170718-312B | |
| Zellzähler Bright-Line Hämazytometer mit Zellzählkammer-Objektträgern | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Zellvertiefungen: 6 Brunnen mit Deckel | CORNING | 25810 | |
| Zentrifugenkonische Röhrchen | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Zentrifuge Eppendorf Röhrchen | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Kulturröhrchen | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Schar | Kostenlose Version | |
| CytoFlex LX Zytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin gelbliches | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon Röhrchen 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon Röhrchen 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fötales Kälberserum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatine | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hämatoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Inkubator | Thermo Sc. | ||
| Ketamin Pet (Ketamin-Clorhidrat) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamin | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM Software Zen 2009 V5.5 | Kostenlose Version | ||
| Biologische Sicherheitswerkbank Klasse II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluoreszenzmikroskop | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverses Mikroskop | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Mikroröhrchen 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Mikroröhrchen 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Mikropipetten 0,2-2 μ L | Finnpipette | E97743 | |
| Mikropipetten 2-20 μ L | Finnpipette | F54167 | |
| Mikropipetten 20-200 μ L | Finnpipette | G32419 | |
| Mikropipetten 100-1000 μ L | Finnpipette | FJ39895 | |
| Stickstofftank Flüssigkeit | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyd | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO / Thermo Sc. | ||
| Petrischale Zellkultur | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipettenspitzen | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (Pentobarbital-Natrium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Kaliumchlorid | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Kaliumphosphat dibasisch | J.T. Baker | 2139900 | |
| S1 Pipettenfüller | Thermo Sc | 9531 | |
| Serologische Pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serologische Pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Natriumbicarbonat | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Natriumchlorid | J.T.Baker | 15368426 | |
| Natriumphosphat Dibasisch wasserfrei | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Natriumpyruvat | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Spritzenfilter steril | CORNING | 431222 | |
| Spektralphotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titerplattenschüttler | LAB-LINE | 1250 | |
| Transferpipetten | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blau Färbung | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagenz 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (Xylazinhydrochlorid) | Pet' s Pharma | Q-7972-025 |
Referenzen
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
