Summary
Aquí se describe un método mejorado para medir los perfiles de hidratación del polen en Arabidopsis thaliana . El nuevo método ofrece una resolución más alta, no es invasivo y es altamente reproducible. El protocolo representa una nueva herramienta para una disección más fina de los procesos que regulan las primeras etapas de la polinización.
Abstract
La reproducción sexual en plantas con flores requiere una interacción inicial entre el grano de polen y la superficie estigmatizada, donde se establece un diálogo molecular entre los socios que interactúan. Los estudios en una variedad de especies han revelado que una serie de puntos de control molecular regulan la interacción polen-estigma para garantizar que solo el polen compatible, generalmente intraespecífico, tenga éxito en efectuar la fertilización. En especies que poseen un "estigma seco", como la planta modelo Arabidopsis thaliana, el primer punto de control de compatibilidad precigótica posterior a la polinización es el establecimiento de la hidratación del polen.
Esta fase de polinización está estrictamente regulada, por lo que las señales del grano de polen provocan la liberación de agua del estigma, lo que permite la hidratación del polen. La capacidad de medir y rastrear con precisión la hidratación del polen a lo largo del tiempo es clave para el diseño de experimentos dirigidos a comprender la regulación de este paso crítico en la reproducción. Los protocolos publicados con frecuencia utilizan flores que han sido extirpadas de la planta madre, mantenidas en medios líquidos o sólidos y polinizadas a granel.
Este documento describe un bioensayo de polinización in vivo no invasivo que permite el seguimiento minuto a minuto de la hidratación de granos individuales de polen de A. thaliana a alta resolución. El ensayo es altamente reproducible, capaz de detectar variaciones muy sutiles de los perfiles de hidratación del polen y, por lo tanto, es adecuado para el análisis de mutantes que afectan las vías que regulan la polinización. Aunque el protocolo es más largo que los descritos para polinización a granel, la precisión y reproducibilidad que proporciona, junto con su naturaleza in vivo , lo hacen ideal para la disección detallada de fenotipos de polinización.
Introduction
La reproducción sexual exitosa en las angiospermas generalmente se basa en la transferencia de granos de polen intraespecíficos de la antera al estigma, ya sea dentro o entre individuos (es decir, polinización). Esta transferencia de granos de polen a una flor receptiva suele estar mediada por polinizadores o factores abióticos; Como tal, esto también resulta con frecuencia en la deposición de polen heteroespecífico en condiciones naturales. Con algunas excepciones, la progresión de la polinización por polen heteroespecífico es evolutivamente desventajosa, reduciendo la aptitud reproductiva a través de la pérdida de oportunidades de apareamiento, con la mayoría de la progenie híbrida resultante que no se desarrolla adecuadamente o es estéril1. Así, los mecanismos han evolucionado para bloquear la polinización por polen heteroespecífico "incompatible"2. El reconocimiento rápido del polen compatible es, por lo tanto, posiblemente el proceso más importante en las primeras etapas de la reproducción sexual en muchas plantas con flores.
En la familia Brassicaceae, donde los estigmas son del tipo "seco", una serie de puntos de control molecular actúan en múltiples etapas del proceso reproductivo regulando la polinización, de modo que solo el polen compatible tiene éxito. La hidratación del polen es uno de los puntos de control más importantes (Figura 1), ya que el polen que no se hidrata no puede progresar para producir un tubo polínico y posteriormente entregar espermatozoides al gametofito femenino. Con frecuencia, los granos incompatibles no pasan este primer punto de control de polinización y, por lo tanto, no tienen acceso al agua estigmatizada3. Entre los miembros de la familia Brassicaceae, el reconocimiento del polen ocurre rápidamente, estableciéndose la compatibilidad a los pocos minutos de la fijación del grano de polen al pistilo 4,5. En los últimos años, se ha avanzado mucho, y ahora estamos empezando a comprender los mecanismos moleculares que regulan los puntos de control clave de la polinización.
Figura 1: Descripción general de los eventos clave durante la polinización compatible. Estas etapas, como la hidratación del polen y la germinación del tubo polínico, también son "puntos de control" de polinización que deben navegarse con éxito para efectuar una polinización compatible. El diagrama representa un estigma de tipo 'seco', que es típico de las especies de la familia Brassicaceae 2,20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La investigación pionera sobre el sistema de autoincompatibilidad (SI) de Brassica, donde el polen "propio" es reconocido y rechazado, estableció el paradigma para el reconocimiento del polen-estigma en Brassicaceae 6,7,8,9,10. El IS en Brassica y sus parientes está mediado por proteínas de "reconocimiento" que residen en la superficie del polen y en la membrana plasmática estigmatizada que, tras la interacción, conducen al rechazo del polen. El rechazo del polen del SI opera mediante la interrupción del sistema de compatibilidad polen-estigma basal que, cuando se activa completamente por la percepción del polen compatible, conduce a una secreción dirigida por el estigma, impulsando así la hidratación del polen (para revisiones del mecanismo de compatibilidad del polen, ver11,12). En el ejemplo de SI, el ligando transmitido por el polen es una pequeña proteína rica en cisteína, rica en cisteína S-locus (SCR/SP11), y el receptor estigmatizado es la quinasa receptora del locus S (SRK).
Recientemente, en Arabidopsis thaliana, se ha encontrado que otro grupo de pequeñas proteínas transmitidas por el polen ricas en cisteína, la proteína de recubrimiento del polen clase B (AtPCP-Bs), son importantes reguladores de la aceptación del polen a través de la activación de la hidratación del polen13. Los receptores estigmatizados de los AtPCP-B y aspectos de la vía reguladora aguas abajo también se han descrito recientemente14,15. Curiosamente, los estudios mutacionales de genes que codifican posibles mediadores de señalización de la hidratación del polen y enigmáticos transmitidos por el polen (incluidos losPCP-B) no han logrado generar plantas que tengan un bloqueo completo en el punto de control de hidratación del polen. Esto sugiere fuertemente que muchos otros factores, aún no descubiertos, juegan un papel en la regulación de la hidratación del polen. Sobre la base del método descrito por primera vez por Wang et al.13, aquí describimos un bioensayo in vivo mejorado de alta resolución adecuado para la identificación de defectos sutiles de hidratación del polen en líneas candidatas mutantes de A. thaliana.
Protocol
1. Crecimiento de las plantas y preparación de las flores.
- Estratificar las semillas de A. thaliana en agarosa al 0,1% o agua estéril durante 3 días a 4 °C, o como semillas secas durante 16-24 h a -20 °C (uNASC, comunicación personal).
- Transfiera las semillas estratificadas a macetas de compost y colóquelas en una cámara de crecimiento ambientalmente controlada. Propagar plantas con un fotoperiodo de 16:8 h, luz:oscuridad proporcionado por tubos fluorescentes (130 μmol m-2 s-1). Mantener la temperatura a 21 ± 2 °C con aproximadamente un 40% de humedad relativa.
- Asegúrese de que las plantas donantes y receptoras de polen, junto con cualquier otra línea de plantas de "control" apropiadas, se siembran juntas para garantizar una floración sincrónica. Propague las plantas durante aproximadamente 6 semanas hasta que las inflorescencias estén bien establecidas.
- Seleccione los botones florales de la etapa 12 en la planta receptora del polen 1 día antes de realizar el bioensayo para la emasculación16,17-estos son capullos florales sin abrir que completarán la apertura de la flor y la dehiscencia de la antera al díasiguiente 18.
NOTA: Evite las tres primeras flores producidas en la inflorescencia principal, ya que generalmente exhiben un comportamiento reproductivo inusual. Si está disponible y es apropiado para el estudio, use una línea de plantas estériles masculinas, como la línea de a-barnasa pA9 de A . thaliana (acceso Col-0 ), donde las anteras no maduran19. - Para castrar las flores del receptor de polen, coloque la planta, en su maceta, de lado. Pegue el tallo de la planta, en la región cercana a las flores que serán castradas, a un portaobjetos de vidrio que esté en posición bajo un microscopio de disección estéreo.
- Usando un par de pinzas de punta fina, abra cuidadosamente el capullo de la flor y retire todos los pétalos y anteras de las flores. Asegúrese de que el pistilo no esté dañado y que el estigma esté libre de polen contaminante.
NOTA: Las líneas de plantas estériles masculinas no requieren emasculación. - Devuelva las plantas a la cámara de crecimiento y asegúrese de que las flores castradas no entren en contacto con otras plantas u objetos extraños.
2. Ensayo de hidratación de polen: adquisición de datos sin procesar
- A la mañana siguiente, retire las plantas de la cámara de crecimiento. Coloque la planta receptora de polen de lado y coloque la flor en el escenario de un microscopio invertido (Figura 2) para que el estigma pueda ser claramente visualizado.
- Fije la posición de la flor a fotografiar inmovilizando el tallo a un portaobjetos de vidrio con tiras de cinta adhesiva. Mantener la temperatura entre 18 °C y 25 °C y la humedad relativa por debajo del 60%.
NOTA: Para la línea de plantas estériles masculinas pA9-barnasa, es óptimo realizar el ensayo por la mañana cuando las flores se abren y los pétalos no obstaculizan el campo de visión. - A continuación, retire una flor sana y recién abierta de la planta donante de polen. Colóquelo bajo un microscopio de disección y reúna algunos granos de polen en la punta de pinzas limpias de punta fina tocando suavemente las anteras (Figura 3A). Una pestaña pegada con cinta adhesiva a una varilla corta también es una herramienta eficaz para recolectar y transferir polen (Figura 3C).
- Retire el exceso de polen de las pinzas tocándolas ligeramente contra los pétalos de las flores de donde se cosecharon los granos de polen, hasta que se forme una monocapa de granos de polen en la punta de las pinzas.
NOTA: Una monocapa de granos de polen en la punta de las pinzas de punta fina facilitará significativamente la transferencia de grano único en los pasos posteriores. También es posible obtener un solo grano de polen en los fórceps mediante esta técnica (Video Suplementario S1). - Regrese a la planta receptora de polen y, usando una lente de objetivo de baja potencia (por ejemplo, lente de objetivo 10x; Figura 3B), enfocar el microscopio invertido en el estigma a polinizar.
- Sosteniendo los fórceps a lo largo de la abertura entre los brazos de los fórceps (Figura 4), acérquese cuidadosamente a una célula de papila estigmatizada no polinizada ('virgen').
NOTA: Hemos encontrado que este método de sostener los fórceps ayuda a la destreza y reduce el impacto de estrechar la mano. Un micromanipulador se puede utilizar para usuarios que tienen menos experiencia o tienen dificultades para aplicar con precisión un solo grano de polen a mano. - Seleccione un grano de polen colocado adecuadamente en los fórceps para transferirlo al estigma. Continúe acercándose a la célula de papila estigmatizada no polinizada hasta que el grano de polen seleccionado haga contacto ligero con su superficie. Retire lentamente los fórceps y confirme la fijación del polen (Figura 5).
NOTA: El video suplementario S1 y el video suplementario S2 demuestran este paso con granos de polen simples y múltiples presentes en las pinzas. - Asegúrese de que el grano de polen esté orientado de tal manera que su eje ecuatorial sea claramente visible y esté bien enfocado. Cambie inmediatamente a una lente de objetivo de mayor potencia (por ejemplo, 20x) y capture una imagen del grano de polen. Esta primera imagen es T = 0. Continúe capturando más imágenes a intervalos de 1 minuto para un total de 10 minutos.
- Ajuste el enfoque según sea necesario para acomodar pequeños movimientos en el grano de polen o estigma. Registre la temperatura ambiente y la humedad relativa de la habitación cada 2 minutos para permitir futuras comparaciones entre réplicas experimentales.
- Una vez que se hayan capturado todas las imágenes, guárdelas en un formato sin pérdidas, como el formato propietario del fabricante o como TIFF.
NOTA: Habrá 11 imágenes por grano de polen muestreado (Figura Suplementaria S1). La configuración de adquisición de lapso de tiempo automatizada / manual en la mayoría del software de adquisición de imágenes propietario son características útiles para facilitar la organización de cada serie temporal. - Repita los pasos 2.4 a 2.9 para granos de polen adicionales. Adquirir datos para números casi equivalentes de control (tipo salvaje [WT]) y polinización experimental.
Figura 2: Configuración del equipo utilizado para el bioensayo de hidratación del polen. En este ejemplo, una línea de plantas estériles macho pA9-barnasa fue el receptor del polen. La planta, dentro de su maceta, se colocó de lado, y el tallo se pegó con cinta adhesiva a un portaobjetos de vidrio colocado en el escenario del microscopio. Para reducir el estrés mecánico y ayudar al posicionamiento de la planta, se utilizó una plataforma ajustable para soportar la maceta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recolección de granos de polen de la flor donante de polen. Las imágenes muestran el uso de (A) pinzas de punta fina y (C) un pedazo de pestaña. Los grupos de polen (flecha roja) deben eliminarse tocándolos ligeramente contra los pétalos de las flores donantes hasta que se obtenga una monocapa de granos de polen (flecha verde). (B) Imagen de alta resolución de un estigma de línea estéril masculina de A. thaliana (Col-0) pA9-barnasa no polinizada que ha alcanzado la etapa de desarrollo apropiada para el bioensayo de hidratación del polen. Barra de escala = 100 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Método para sujetar fórceps al transferir polen al estigma receptor. (A) Orientación incorrecta para sostener los fórceps; (B) orientación correcta para sujetar los fórceps. Sostener los fórceps hacia los lados en esta configuración, como lo indica la posición del pulgar entre los brazos de los fórceps, proporciona una mayor estabilidad para facilitar la transferencia de granos de polen a papilas estigmáticas no polinizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Transferencia de un solo grano de polen desde la punta de un par de fórceps a una célula de papila estigmatizada no polinizada ('virgen') de una planta estéril macho pA9-barnasa. (A) Enfoque cuidadoso hacia la célula de la papila. (B) Fijación de un grano de polen colocado apropiadamente (flecha azul) a la celda de papila (flecha naranja). (C) Retirada de los fórceps y confirmación visual de la fijación del polen (flecha púrpura). Los paneles A-C fueron fotografiados con una lente de objetivo 10x (distancia de trabajo de 10,5 mm; apertura numérica de 0,25) y son instantáneas derivadas del videoclip presentado en el Video Suplementario S1. (D) Transición a una lente de objetivo 20x (distancia de trabajo de 2,1 mm; apertura numérica de 0,5) para iniciar la captura de imágenes en una serie temporal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Mediciones del ensayo de hidratación del polen
- Defina la tasa de hidratación del polen como el cambio en la longitud del semieje menor (Figura 6) del grano de polen (es decir, el radio ecuatorial) a lo largo del tiempo y preséntelo como cambio porcentual (ecuación [1]):
(1) - Usando software de análisis de imágenes, registre los valores de ejes semimenores para cada grano de polen en la serie experimental.
NOTA: El nombre de esta opción de medición depende del software, como 'Elipse girada' o 'Elipse de 5 puntos'. - Repita los pasos 3.1-3.2 para todos los demás granos de polen que se van a medir. Para mantener la coherencia, aplique el mismo grado de zoom digital y el mismo enfoque para definir el "límite de polen" para todas las mediciones en los conjuntos de datos.
- Una vez que se hayan completado todas las mediciones para una serie temporal, exporte los valores de eje semisecundario sin procesar de cada pila de imágenes a una hoja de cálculo y presente los datos en columnas por pila de imágenes. Asegurar la inclusión de datos de al menos 15 granos de polen hidratados en el análisis para cada línea de plantas (Tabla Suplementaria S1).
- No es inusual que un pequeño número de granos de polen no se hidrate o se hidrate significativamente más lentamente de lo esperado. Estos granos "fallidos" pueden ser el resultado de un contacto deficiente entre el grano y la célula de la papila o estar relacionados con la viabilidad del polen. Busque y excluya estos del conjunto de datos a menos que sean necesarios en su diseño experimental.
- Calcule los valores medios para cada punto de tiempo por línea de planta. Utilice pruebas t no pareadas y ANOVA unidireccional para el análisis estadístico de los datos de hidratación de WT y líneas mutantes en cada punto de tiempo. Utilice una prueba t múltiple para la comparación simultánea de las medias entre WT y las líneas mutantes en múltiples puntos de tiempo.
NOTA: Las gráficas XY también son muy útiles para visualizar la tendencia general de hidratación del polen entre las líneas de plantas que se comparan.
(1)
Figura 6: WT grano de polen hidratado sobre una célula de papila estigmatizada de A. thaliana (Col-0; línea estéril masculina pA9-barnasa). (A) Punto de tiempo cero, 0 (0 MAP) y (B) 10 MAP. El círculo rojo alrededor del grano de polen es el "límite de polen" definido y dibujado por el operador utilizando un software de análisis de imágenes. Las líneas verde y roja oscura dentro del polen representan los ejes semi-mayor y semi-menor, respectivamente. La longitud del semieje menor se utiliza para calcular el grado de hidratación del polen. Una serie cronológica completa de este conjunto de datos se puede encontrar en la Figura Suplementaria S1. La imagen fue tomada con una lente de objetivo 20x (distancia de trabajo de 2,1 mm; apertura numérica de 0,5). Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: MAP = min-after-pollination. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Representative Results
Esta sección presenta dos conjuntos de ejemplos de datos de hidratación del polen, recopilados como se describió anteriormente, para A. thaliana. El primer conjunto de datos consiste en tres réplicas de una serie temporal de hidratación de polen para plantas WT, y cada réplica se recolecta en un día diferente. Cada réplica contiene no menos de 18 valores individuales de grano de polen, totalizando 55 granos de polen en las tres réplicas. Los valores mínimos y máximos para las medias entre réplicas, para todos los puntos temporales, estaban dentro del 3% (Figura 7 y Tabla Suplementaria S1). Estos datos representativos para la polinización de WT demuestran claramente el alto grado de consistencia que se puede obtener utilizando la metodología detallada aquí para números de muestra relativamente bajos y en diferentes días.
Figura 7: Gráfico XY que muestra la consistencia de los perfiles de hidratación de polen de tipo silvestre de A. thaliana durante un período de tiempo de 10 minutos. El progenitor del polen fue la accesión Col-0 de A. thaliana y el progenitor pistilo fue la línea de A. thaliana estéril macho pA9-barnasa (Col-0). Los datos representan tres conjuntos de datos independientes recopilados en diferentes días y demuestran un alto grado de consistencia. En la figura suplementaria S2 se presenta un diagrama de caja y bigotes y un análisis estadístico de las medias para estos conjuntos de datos. El número de polen medido ('n') para cada conjunto de datos independiente se muestra junto a la sintaxis (WT1/WT2/WT3) en la figura. Abreviatura: WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El segundo conjunto de datos se obtuvo para una línea vegetal que alberga una inserción de ADN-T en un gen codificador de proteínas de recubrimiento de polen que genera una mutación de "derribo", en lo sucesivo denominada "mutante KD". El polen mutante se depositó en estigmas estériles masculinos de pA9-barnasa para el perfil de hidratación, como se describe en el protocolo. Como se puede ver en los datos resultantes (Figura 8), el polen mutante y WT tenían perfiles de hidratación indistinguibles durante los primeros 5 minutos. Sin embargo, 5-10 min después de la polinización (MAP), el cambio medio del eje semimenor para el polen mutante comenzó a caer detrás del polen WT, con la diferencia volviéndose estadísticamente significativa a 10 MAP. Este resultado no solo demuestra que esta proteína de la capa de polen tiene un papel en la mediación de la hidratación del polen, sino que también ilustra muy bien la utilidad de este bioensayo de grano único de alta resolución para rastrear la hidratación del polen. En este ejemplo en particular, su sensibilidad fue capaz de detectar el efecto sutil de un "derribo" de un gen codificador de proteínas de recubrimiento de polen.
Figura 8: Perfiles de hidratación del polen para WT y una línea mutante de proteína de recubrimiento de polen (mutante KD) «derribada». (A) Perfiles de hidratación durante un período de tiempo de 10 minutos para WT y polen mutante. Los padres del polen fueron la adhesión Col-0 de A. thaliana y la proteína de recubrimiento polínico KD mutante (también en el fondo Col-0). En ambos casos, el pistilo padre fue la línea macho estéril pA9-barnasa macho estéril A. thaliana (Col-0). (B) Diagramas de caja y bigotes que muestran el grado de hidratación del polen (en términos de cambio porcentual del semieje menor) en 5 MAP y 10 MAP para conjuntos de datos de polen WT y mutante. Los bigotes representan valores mínimos y máximos de muestra. Los cuadros representan el cuartil inferior, la mediana y el cuartil superior del conjunto de datos. Las cruces blancas representan la media del conjunto de datos. El análisis de la prueba t no pareada muestra que el porcentaje medio de hidratación del polen es significativamente diferente entre las dos líneas de plantas a 10 MAP. Un asterisco indica p < 0,05 (prueba t no pareada). Abreviaturas: WT = tipo salvaje; KD = derribo; MAPA = min-post-polinización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Serie temporal de bioensayo de hidratación de polen recortado de un grano de polen WT hidratado en una célula de papila estigmatizada de una planta estéril macho de pA9-barnasa en el transcurso de 10 min. Las imágenes se tomaron a intervalos de 1 minuto. Las imágenes a 0 MAP y 10 MAP se utilizaron en la Figura 6 (adjuntas por separado). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: WT = tipo salvaje; MAPA = min-post-polinización. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Diagrama de caja y bigotes que muestra el grado de hidratación del polen (en términos de cambio porcentual del semieje menor) durante un período de tiempo de 10 minutos para los tres conjuntos de datos de polen WT descritos en la Figura 7. El pistilo padre fue la línea de A. thaliana (Col-0) macho estéril macho de pA9-barnasa. Los bigotes representan valores mínimos y máximos de muestra. Los cuadros muestran el cuartil inferior (bisagra inferior), la mediana (bisagra central) y el cuartil superior (bisagra superior) del conjunto de datos. Se muestran los puntos de datos individuales. El ANOVA unidireccional muestra que el porcentaje medio de valores de hidratación del polen entre los tres conjuntos de datos no fueron estadísticamente significativamente diferentes entre sí durante el período de tiempo de 10 minutos. El umbral significativo es p < 0,05 (ANOVA unidireccional). Abreviatura: WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria S1: Datos de hidratación del polen bruto utilizados para construir la Figura 7 (polen de A. thaliana WT Col-0 en estigma estéril masculino de pA9-barnasa). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario S1: Un video que demuestra la transferencia de un solo grano de polen WT (Col-0 accesion) en la punta de un par de fórceps a una célula papila esigmática "virgen" (línea estéril masculina pA9-barnasa). Para facilitar la accesibilidad del video, la calidad de imagen se redujo intencionalmente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario S2: Un video que demuestra la transferencia de un solo polen WT (Col-0 accesion) de una monocapa de granos de polen en la punta de un par de fórceps a una célula de papila estigmatizada "virgen" (línea estéril masculina pA9-barnasa). Para facilitar la accesibilidad del video, la calidad de imagen se redujo intencionalmente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Para las plantas con flores, las primeras etapas de la reproducción sexual son posiblemente las más importantes. A nivel de la interacción polen-estigma, se toman decisiones moleculares que determinan la "compatibilidad" de los socios que interactúan. Tales decisiones, si se toman correctamente, evitan el desperdicio de recursos que podrían afectar la aptitud reproductiva21. Por lo tanto, permitir que solo el polen compatible efectúe la fertilización es un componente importante para mantener genotipos bien adaptados y, por lo tanto, para el éxito evolutivo de las especies. La investigación realizada con la planta modelo A. thaliana ha sido extremadamente valiosa para profundizar nuestra comprensión de este proceso. Varios estudios realizados en las últimas décadas han revelado la presencia de factores en la capa de polen que actúan en el primer "punto de control" de compatibilidad, donde el polen obtiene acceso al agua estigmatizada para permitir la hidratación del polen13. A pesar de estas primeras ideas sobre los mecanismos que regulan la compatibilidad polen-estigma, todavía hay muchas lagunas en nuestra comprensión de este proceso. Hasta la fecha, ningún mutante de ligandos transmitidos por el polen o receptores estigmatizados conocidos por afectar la hidratación del polen puede bloquear completamente la polinización compatible, lo que sugiere la presencia de otros determinantes de hidratación del polen no descubiertos. Al poder observar fácilmente el fenotipo de interés, el bioensayo de hidratación del polen descrito aquí es una de las técnicas más sencillas para estudiar los mutantes potenciales que regulan la polinización.
Las metodologías existentes para medir la hidratación del polen comúnmente utilizan polinización a granel e informan menos puntos de tiempo 14,22,23, y por lo tanto pueden pasar por alto importantes fenotipos de perfil de hidratación sutil. Por ejemplo, el estudio de Wang et al.13, junto con el trabajo sobre otros mutantes de proteínas de recubrimiento de polen en nuestro laboratorio (observaciones no publicadas), han revelado diferencias intrigantes en los perfiles de hidratación entre mutantes. Tales diferencias sutiles pueden contener pistas importantes sobre los mecanismos reguladores que subyacen a la polinización compatible.
El método descrito aquí se centra en la adquisición de un número relativamente pequeño de mediciones entre líneas de plantas mutantes y WT, con énfasis en la precisión metodológica para reducir la variación dentro de los conjuntos de datos. Si bien este método es altamente reproducible (como se muestra en la Figura 7), suponiendo que la temperatura y la humedad se controlen adecuadamente, es importante recopilar datos de hidratación para un número casi igual de WT y polen mutante en el mismo día para reducir aún más el potencial de variación. Los datos se pueden agrupar en diferentes días si es necesario. Además, seleccionar las plantas de control WT adecuadas es vital para la correcta interpretación de los resultados de hidratación. Para el receptor de polen, se debe usar la misma línea de plantas para recibir tanto el control de WT como los granos de polen mutantes.
Por ejemplo, utilizamos la línea de plantas estériles masculinas pA9-barnasa, que también aparece en el protocolo de video, como receptor de polen tanto para WT (control) como para polen mutante (experimental) cuando investigamos líneas mutantes de polen de ADN-T (como el mutante 'KD' descrito en la Figura 8). Se debe evitar la mezcla de datos de una línea estéril masculina de este tipo, que no necesita ser castrada, con los recopilados de una línea de control castrada manualmente, ya que estos estigmas probablemente se comportarán de manera diferente. Del mismo modo, las líneas mutantes castradas deben utilizarse junto con una línea WT (control) castrada siempre que sea posible. La misma precaución también debe aplicarse al considerar los antecedentes genéticos de las plantas en estudio. Mientras que las colecciones mutantes de ADN-T más populares se generaron en el fondo Col-0, otras, como la colección FLAG del Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), están disponibles en el fondo genético de Wassilewskija (WS)24,25. En tales casos, es aconsejable utilizar las líneas de plantas WT del ecotipo respectivo como controles.
Aunque aquí nos hemos centrado en la hidratación del polen durante los primeros 10 minutos de la interacción polen-estigma, este método también se puede adaptar para abarcar perfiles de hidratación que cubren un período de tiempo más largo. Una característica clave del protocolo es que las flores permanecen unidas a la planta madre; los protocolos publicados por corriente generalmente requieren la escisión del pistilo y la colocación en medios para sostener el tejido durante la duración del experimento14,18,26. Aunque no hay evidencia directa que sugiera que tal enfoque semi in vivo afecte la hidratación del polen o de hecho altere la regulación in vivo de este proceso, es concebible que la escisión de las flores de la planta madre pueda afectar la polinización. Así, este protocolo consigue un verdadero ambiente in vivo para el estudio de la interacción polen-estigma, donde se preserva la integridad estructural de la planta.
La transferencia de granos de polen individuales a papilas estigmatizadas "vírgenes" es posiblemente una de las operaciones más desafiantes descritas en este protocolo. No es raro transferir grupos de granos de polen por error. Sin embargo, la posibilidad de que esto ocurra puede reducirse en gran medida asegurándose de que solo una monocapa de polen esté presente en las pinzas (Figura 3A) (o incluso un solo grano de polen; Figura 5), y/o utilizando granos de polen que ya están orientados, de tal manera que "sobresalen" de otros en la punta de los fórceps. Hemos descubierto que un operador experimentado puede completar con éxito la transferencia de un solo polen a una célula de papila estigmatizada en aproximadamente 3 minutos y registrar datos de hasta cinco granos de polen durante un período de 1 hora. Por lo tanto, durante un período de 2-4 días, se pueden acumular suficientes datos para un análisis estadístico significativo de las líneas de plantas en estudio.
El error humano es potencialmente la mayor fuente de variación en el análisis de conjuntos de datos derivados de estudios que utilizan este protocolo. Por ejemplo, la definición del "límite del polen" durante el análisis de imágenes se reduce al juicio del investigador individual. Por lo tanto, existe la posibilidad de que las mediciones realizadas por diferentes investigadores, incluso en el mismo conjunto de datos, puedan generar variación. Siempre que sea posible, un solo investigador debe llevar a cabo las mediciones para minimizar los errores de muestreo. Además, el acoplamiento del análisis de WT y conjuntos de datos mutantes por el mismo operador niega la definición potencialmente subjetiva del «límite del polen» y la variación entre operadores.
En conclusión, se describe un método sofisticado pero preciso para medir los perfiles de hidratación del polen en el organismo modelo A. thaliana. Hemos demostrado que, al utilizar este protocolo, se pueden adquirir fácilmente datos de hidratación de polen altamente consistentes para A. thaliana. Tres lotes independientes de datos para polinización de WT adquiridos en diferentes días mostraron pequeñas desviaciones consistentes del <3% en todos los puntos temporales (Figura 7 y Tabla Suplementaria S1). Aunque el bioensayo presentado aquí es ligeramente más complejo que la mayoría de los protocolos existentes, la resolución de los datos generados es superior y adecuada para la identificación y caracterización de nuevos mutantes que impactan en las vías que regulan la polinización compatible.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por las becas de posgrado de la Universidad de Bath (Universidad de Bath, Bath, Reino Unido, BA2 7AY) para Y.-L.L. y L.W. La Figura 1 fue creada con BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
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