用于流式细胞术补偿对照的卟啉修饰微珠

摘要

本方案描述了如何通过氨基功能化的聚苯乙烯微球与卟啉化合物TCPP及酰胺偶联试剂EDC反应，制备用于流式细胞术的卟啉基补偿微球。采用过滤步骤以减少颗粒状副产物。

摘要

流式细胞术可根据荧光测量结果快速表征和定量不同的细胞群体。首先用一种或多种荧光试剂对细胞进行染色，每种试剂连接有不同的荧光分子（荧光素），可依据细胞的表型特征（如细胞表面抗原表达）选择性地结合细胞。流式细胞仪可通过检测特定波长范围的通道，测量每种试剂结合到细胞后产生的荧光强度。当使用多种荧光素时，单个荧光素发出的光常会溢出至非目标检测通道，因此需要对荧光强度数据进行校正，该过程称为补偿。

在细胞标记实验中，每种使用的荧光染料均需要相应的补偿对照颗粒，通常为结合单一荧光染料的聚合物微球。流式细胞仪采集的补偿颗粒数据可用于校正荧光强度测量值。本方案描述了共价修饰有荧光试剂 meso-四(4-羧基苯基)卟啉（TCPP）的聚苯乙烯补偿微球的制备与纯化方法，及其在流式细胞术补偿中的应用。本研究中，将氨基功能化的聚苯乙烯微球在 pH 6、室温条件下，与 TCPP 及酰胺偶联试剂 EDC（N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐）共同孵育 16 小时，并持续振荡。通过离心收集 TCPP 微球，并重悬于 pH 7 的缓冲液中保存。实验过程中观察到 TCPP 相关颗粒物作为副产物生成，可通过可选的过滤步骤减少其数量。所制备的 TCPP 微球已成功应用于多荧光标记人痰细胞实验中的流式细胞术补偿。TCPP 微球在冰箱中储存 300 天后仍保持稳定。

引言

由于具有荧光特性和肿瘤靶向性，卟啉类化合物多年来在生物医学领域备受关注^1,2,3。光动力治疗（PDT）和声动力治疗（SDT）等治疗应用需要将卟啉类药物系统性地给予癌症患者，使其在肿瘤组织中富集，随后对肿瘤局部施加特定波长的激光或超声照射。激光或超声的刺激可促使卟啉产生活性氧，进而导致细胞死亡^4,5。在光动力诊断（PDD）中，利用卟啉的荧光特性可区分癌细胞与正常细胞⁶。在此背景下，原卟啉IX是一种天然的荧光性卟啉，在系统性或局部注射其前体5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）后，可在肿瘤组织中富集，已被用于识别胃肠道间质瘤、膀胱癌和脑癌^7,8。最近，研究人员还探索了使用5-ALA处理来检测多发性骨髓瘤中微小残留病灶的可能性⁹。本实验室一直采用四芳基卟啉TCPP（5,10,15,20-四（4-羧基苯基）-21,23H-卟吩），因其能够选择性地染色人类痰液样本中的肺癌细胞及与癌症相关的细胞，该特性已被应用于基于载玻片....

方案

所有操作均需在使用适当个人防护装备的情况下进行。

1. TCPP 储备液的制备，1.0 mg/mL

注意：可每月制备一次。

1. 使用分析天平、药匙和称量纸，称取 49.0–50.9 mg 的 TCPP。将称量结果精确至 0.1 mg。将称好的 TCPP 避光保存备用。
   注意：若称量读数不稳定，可使用除静电枪。
2. 根据步骤 1.1 中称得的 TCPP 质量，从表 1中确定所需纯水和异丙醇（IPA）的用量。将纯水和异丙醇加入一个 100 mL 玻璃烧杯中，并用封口膜覆盖，防止挥发。
3. 根据步骤 1.1 中称得的 TCPP 质量，从表 1中确定所需碳酸氢钠的用量。
4. 使用分析天平、药匙和称量纸，称取步骤 1.3 中确定的所需量的碳酸氢钠。将称量结果精确至 0.1 mg。
   注意：若称量读数不稳定，可使用除静电枪。
5. 将称好的碳酸氢钠加入 含有纯水和异丙醇的 100 mL 烧杯中。用封口膜覆盖溶液，防止挥发。
6. 将步骤 1.5 得到的溶液置于搅拌器上搅拌，直至完全溶解（约 10 分钟）。
7. 测定 pH 值，确保步骤 1.6 中含碳酸氢钠的溶液 pH 值在 9 至 10....

结果

该TCPP标记微珠的实验方案相对快速且高效。图1展示了通过流式细胞术测定的TCPP微珠标记过程的代表性结果。图1A显示了Rainbow微珠在检测TCPP的适当通道中的标准化谱图。这些微珠用于对流式细胞仪检测TCPP时的激光电压进行标准化质控。图1B显示了经胺基功能化的聚苯乙烯微珠（TCPP标记微珠）的光散射谱图。图1C显示了非功能化微珠（未标记微珠）的光散射谱图；我们将其用作阴性微珠对照，以计算补偿矩阵。红色矩形所示的群体在未标记微珠悬液中不存在，代表了TCPP与偶联试剂EDC接触后形成的与TCPP相关的颗粒聚集体。在测定微珠荧光强度（FI）时，应排除此类聚集体。图1D显示了通过图1B中黑色门控选中的标记微珠的FI，其值明显比（未设门控的）未标记微珠的FI高出数个数量级（比较

讨论

尽管卟啉在癌症诊断和治疗中具有多种应用²，但关于其作为流式细胞术试剂用于区分原代人体组织中癌细胞与非癌细胞群体的潜在用途，相关文献仍十分有限^24,25,26。我们在对人类痰液进行流式细胞术分析的研究^24,27中，需要使用TCPP及其他几种荧光染料对解离的痰液细胞进行染色。然而，TCPP在其他荧光染料检测通道中的荧光溢出问题，意味着需要一种标记TCPP的微球作为补偿对照。然而，此类微球并无商业产品，必须自行制备。已有文献报道将四芳基卟啉连接到基于二氧化硅的分子筛上^28,29，但基于二氧化硅的颗粒被证明不适合用于制备流式细胞术标准品（数据未显示）。因此，我们的研究集中于聚苯乙烯.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琥珀色塑料离心管，2 mL，U型底，聚丙烯材质	研究产品国际公司	ZC1028-500
胺基功能化的聚苯乙烯-二乙烯基苯交联（PS/DVB）微球，10.6 μm 直径，2.5% w/v 水悬浮液，3.82 x 107 beads/mL，7.11 × 1011 氨基/微珠	Spherotech	APX-100-10	直径规格 8.0–12.9 μm，悬浮液 2.5% w/v 3.82 × 107 beads/mL，7.11 × 1011 氨基/微珠
50 mL 圆锥形管，Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
离心			配备合适的转子
带盖一次性聚苯乙烯瓶，150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC（N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐）， ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS 号：  25952-53-8
FlowJo 单细胞分析软件（v10.6.1）	BD
22 x 22 mm 玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-540-BP
玻璃纤维注射器滤器（Finneran，5 µm，13 mm 直径	托马斯科学公司	1190M60
载玻片，275 × 75 × 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks平衡盐溶液（HBSS）	Fisher Scientific	14-175-095
异丙醇，ACS 级	Fisher Scientific	AC423830010
单通道机械移液器，100-1000 µL，配吸头	Eppendorf	3123000918
MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸，半钠盐）	Sigma	M0164	CAS 编号：  117961-21-4
Navios EX 流式细胞仪	贝克曼库尔特
奥林巴斯BX-40显微镜配备DP73相机、40倍物镜及cellSens软件	Olympus		或类似物
巴斯德吸管，玻璃，5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH计（UB 10 Ultra Basic）	丹佛仪器公司
移液控制器（Drummond）	Pipete.com	DP101
5 mL塑料注射器	Fisher Scientific	14955452
聚苯乙烯颗粒（非功能化），SPHERO  2.5% w/v，8.0–12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
聚丙烯管，15 mL，锥形	Fisher Scientific	14-959-53A
聚苯乙烯试管，圆底	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads（Spherotech URCP-50-2K）	Fisher Scientific	NC9207381
一次性血清移液管 - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
一次性血清移液管 - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma	S6014	CAS 号：  144-55-8
TCPP（meso-四(4-羧基苯基)卟啉）  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS 编号：  14609-54-2
Tecan Spark 酶标仪（或类似设备）	Tecan生命科学
试管旋转混匀仪/旋转器	赛默飞世尔科技	88881001
涡旋混合器	Fisher Scientific	2215365