从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

摘要

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。

摘要

发育中的心脏是一个复杂的结构，包含多种由复杂调控机制控制的前体细胞。对单个细胞的基因表达和染色质状态进行检测，可以识别细胞类型和状态。单细胞测序技术已揭示了心脏前体细胞异质性的多个重要特征。然而，这些方法通常仅限于新鲜组织，这限制了在不同实验条件下的研究，因为新鲜组织必须在同一次实验中立即处理，以减少技术上的变异性。因此，该领域迫切需要简便且灵活的方法，以支持单核RNA测序（snRNA-seq）和基于高通量测序的单核转座酶可及染色质分析（snATAC-seq）等技术的数据生成。本文介绍了一种快速分离细胞核以进行后续单核双组学分析（联合snRNA-seq与snATAC-seq）的实验方案。该方法可从心脏前体细胞的冷冻样本中分离细胞核，并可与使用微流控腔室的平台相结合。

引言

在出生缺陷中，先天性心脏病（CHDs）最为常见，每年约发生在1%的活产婴儿中^1,2。仅在少数病例中可识别出基因突变，表明其他病因（如基因调控异常）也参与了先天性心脏病的发病机制^2,3。心脏发育是一个涉及多种相互作用细胞类型的复杂过程，这使得识别非编码区致病突变及其对基因调控的影响变得极具挑战性。心脏器官发生始于细胞前体，这些前体分化为不同类型的心脏细胞，包括心肌细胞、成纤维细胞、外膜细胞和内膜细胞^4,5。 单细胞基因组学正成为研究心脏发育以及评估细胞异质性在健康与疾病状态下影响的关键方法⁶。多组学技术的发展实现了对不同参数的同步检测，同时计算分析流程的不断拓展，促进了对正常和病变心脏中细胞类型及亚型的发现⁶。本文介绍了一种可靠的单细胞核分离方案，适用于从小鼠胚胎获取的冷冻心脏前体细胞，该方案可兼容后续的snRNA-seq和snATAC-seq分析（也可用于snRNA-seq与snATAC-seq联合分析）^7,<....

方案

本研究采用的动物实验方案已获得马赛大学（Aix-Marseille University，C2EA-14）动物伦理委员会的批准，并依照国家动物实验伦理委员会指定机构批准的方案进行（法国国民教育、高等教育与研究部；授权编号 Apafis N°33927-2021111715507212）。

1. 解剖前设置定时交配

1. 为获取小鼠胚胎，需在心脏区域分离前9.5天进行定时交配。本实验中使用2-6月龄的野生型C57BL/6J小鼠，并在夜间进行定时交配。
2. 次日早晨检查雌鼠是否形成阴道栓。将发现阴道栓的当天记为胚胎发育第0.5天（E0.5）。

2. 组织制备与细胞分离

1. 在受孕后第9.5天处死2至6月龄的C57BL/6J妊娠雌性小鼠 通过 CO₂ 随着浓度增加，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇清洁腹部下部。
   注意：不建议在颈椎脱位前使用麻醉剂，因为这会使胚胎暴露于可能影响后续转录组学和表观基因组学研究的环境变化中。
2. 用剪刀打开腹腔和腹膜。观察子宫角，并用镊子切除两侧子宫角。
3. 将角放入含有冷的完全培养基（含1% FBS）的培养皿中。虽然对体积没有特定要求，但需注意确保胚胎完全浸没在培养基中。每10 c....

结果

与用于单细胞技术的单细胞悬液制备相比，单核悬液的制备更具挑战性，需要更高的分辨率和更精细的处理。成功实现snRNA-seq与snATAC-seq联合分析的关键因素在于获得纯净且完整的细胞核悬液。高效的细胞核分离方案必须根据组织类型和样本状态（新鲜或冷冻）进行相应调整。本文介绍了一种优化后的从小鼠胚胎心脏冷冻组织中分离细胞核的方案。从胚胎心脏区域的解剖、心肌细胞的解离到细胞核的分离，所有步骤均在图1中进行了总结。在起始材料方面，建议用于高效细胞核分离的细胞数量为1×10⁵–1×10⁶个细胞，细胞活力应>70%。如图2所示，本方案中在解冻后额外增加了死细胞去除与分选步骤，从而获得了更纯净的细胞悬液，显著提高了细胞活力，并改善了起始样本的质量。除细胞核分离外，本方案还详细说明了如何评估所分离细胞核的质量与数量（图3）。所分离细胞核的质量会显著影响snRNA-seq与snATAC-seq联合数据的质量；在此，通过评估核膜形态.......

讨论

通过结合单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）研究发育中心脏的细胞组成，有助于更深入理解先天性心脏病的发病机制²⁶。多个研究实验室已探讨了心脏组织冷冻保存对snRNA-seq的影响²⁷。在比较不同实验条件时，使用来自人类疾病小鼠模型的新鲜显微解剖组织进行snRNA-seq和snATAC-seq在操作上可能具有挑战性。对于特定发育阶段，一个难点在于对照组和实验组必须在同一轮实验中处理，以减少样本处理过程中引入的技术变异。当无法处理新鲜组织时，根据我们的研究结果，建议先进行组织解离，然后冷冻保存，而不是直接将整个胚胎心脏组织速冻。选择前一种方法的原因在于，若将心脏组织整体冷冻，解冻后获得有活力的单细胞将更加困难。然而，如果组织解离方案未经过优化，则整体速冻组织可能是更优选择。优先推荐解离后冷冻保存，因为该组织解离方案可获得>90%的新鲜有活力细胞，且无细胞类型偏好性。

这种方法具有多个优势，例如可使用冻存细胞，从而无需新鲜组织；同时采用单细胞解.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2100 生物分析仪	Agilent		无目录编号
5M 氯化钠 (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
10% BSA	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM 芯片 J 单细胞试剂盒，16 次反应	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达试剂套装，4 次反应（含 20X 细胞核缓冲液）	10X Genomics	1000285
Countess 细胞计数板载玻片	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		无目录编号
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind 管	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	无菌且无 RNase
双索引试剂盒 TT Set A，96 次反应	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	热灭活
高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒	Thermofisher	L3224
MACS 死细胞去除试剂盒：死细胞去除 MicroBeads，结合缓冲液 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
氯化镁 (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
McCoy 5A 培养基	Thermofisher	16600082
MS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		无目录编号
青霉素-链霉素 (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
ROCK 抑制剂	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
单索引试剂盒 N Set A，96 次反应	10X Genomics	1000212
标准 90 mm 无菌培养皿 Sterilin	Thermofisher	101R20
无菌双蒸水	Thermofisher	R0582
Trizma 盐酸溶液 (HCl)	Sigma	T2194-100ML
台盼蓝染液 (0.4%)	Invitrogen	T10282
0.05% 胰蛋白酶 - 1X EDTA	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
宽口滤芯移液器吸头 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		无目录编号