Le bis-3-cloropepidine (B-CePs) sono sonde chimiche utili per identificare e caratterizzare le strutture G-quadruplex in modelli di DNA in vitro. Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP e per risolvere i prodotti di reazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide ad alta risoluzione.
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Articolo metodologico
In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine
In questo articolo
Sommario
Abstract
I G-quadruplex (G4) sono strutture di DNA biologicamente rilevanti e non canoniche che svolgono un ruolo importante nell'espressione genica e nelle malattie, rappresentando bersagli terapeutici significativi. Sono necessari metodi accessibili per la caratterizzazione in vitro del DNA all'interno di potenziali sequenze formanti G-quadruplex (PQS). I B-CeP sono una classe di agenti alchilanti che si sono dimostrati utili sonde chimiche per lo studio della struttura di ordine superiore degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un nuovo saggio di mappatura chimica che sfrutta la reattività specifica dei B-CeP con l'N7 delle guanine, seguita da una scissione diretta del filamento ai G alchilati.
Vale a dire, per distinguere le pieghe G4 dalle forme di DNA non ripiegate, usiamo B-CeP 1 per sondare l'aptamero legante la trombina (TBA), un DNA a 15 mer in grado di assumere la disposizione G4. La reazione delle guaine che rispondono a B-CeP con B-CeP 1 produce prodotti che possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) ad alta risoluzione a livello di singolo nucleotide localizzando i singoli addotti di alchilazione e la scissione del filamento di DNA sulle guanine alchilate. La mappatura mediante B-CeP è uno strumento semplice e potente per la caratterizzazione in vitro di sequenze di DNA formanti G-quadruplex, consentendo la localizzazione precisa delle guanine coinvolte nella formazione delle G-tetrade.
Introduzione
Oltre alla tipica doppia elica di Watson-Crick, gli acidi nucleici possono adottare varie strutture secondarie, come la forma alternativa G-quadruplex (G4), a causa delle loro sequenze ricche di guanina. La struttura G4 si basa sulla formazione di tetrameri planari, chiamati G-tetrade, in cui quattro guanine interagiscono attraverso legami idrogeno di Hoogsteen. Le G-tetradi sono impilate e ulteriormente stabilizzate da cationi monovalenti coordinati al centro del nucleo guaninico (Figura 1)1.
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Protocollo
1. Preparazione dell'acido nucleico e della sonda chimica
- Acidi nucleici
NOTA: L'oligonucleotide denominato "TBA" è la sequenza di DNA a 15 meri 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' marcata all'estremità 3' dal fluoroforo 5-carbossifluoresceina (FAM) per consentire la visualizzazione sul gel. L'oligonucleotide non marcato "cTBA" è la sua sequenza complementare al DNA 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA e cTBA sono impiegati per ottenere le tre diverse strutture, come mostrato nella Tabella 1.- Puntali per autoclave e provette da 0,5 mL per ottenere prodotti monouso sterili ed evitare contaminazioni.
- Preparare soluzioni m....
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Risultati
La Figura 2 mostra un risultato rappresentativo di un saggio di mappatura chimica eseguito, come descritto nel protocollo con B-CeP 1 sull'oligonucleotide TBA ripiegato in tre diverse strutture. La disposizione G-quadruplex di TBA (G4-TBA) è stata ottenuta ripiegando l'oligonucleotide in BPE e in presenza del catione K+, mentre la forma a singolo filamento della stessa sequenza TBA (ssTBA) è stata ripiegata in assenza di potassio. Il costrutto a doppio filamento (dsTBA) è stato pr.......
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Discussione
I G-quadruplex sono strutture secondarie di acido nucleico che tipicamente si ripiegano all'interno di sequenze di DNA ricche di guanina e sono obiettivi di ricerca significativi a causa della loro associazione con il controllo genetico e le malattie. La mappatura chimica mediante B-CePs è un protocollo utile per la caratterizzazione del DNA G4s, che può essere utilizzato per identificare le basi guaninica coinvolte nella formazione delle G-tetrade in condizioni fisiologiche di sale.
La sonda .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Farmacologiche dell'Università di Padova (PRIDJ-BIRD2019).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di acrilammide/bis-acrilammide 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonio per-solfato (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Bilancia analitica | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Acido borico | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Blu di bromofenolo Blu brillante R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium idrogeno fosfato dodecaidrato | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotidi | Integrated DNA Technologies | sintesi di sequenze | |
| EDTA disodico | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glicerolo | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro provette 0,5 mL | Sarstedt | 72,704 | |
| Cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Apparecchio di sequenziamento | Biometra | Modello S2 | |
| Soluzione di silanizzazione I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodio fosfato monobasico | Carlo Erba | 480086 | |
| Concentratore Speedvac | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Spettrofotometro UV-Vis | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Riferimenti
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and....
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Ristampe e permessi
