이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 다양한 악성 및 비악성 질환 치료를 위한 유망한 면역 치료 접근법을 나타냅니다. CAR-T 세포는 세포 표면 표적을 인식하고 결합하여 표적 세포를 죽이는 키메라 단백질을 발현하는 유전자 변형 T 세포입니다. 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 오염 위험이 있을 수 있습니다. 자동화된 세포 프로세서인 CliniMACS Prodigy를 사용하면 폐쇄형 시스템에서 임상 규모로 세포 치료제를 제조할 수 있어 오염 위험을 최소화할 수 있습니다. 처리는 컴퓨터의 제어 하에 반자동으로 이루어지므로 프로세스에 대한 사람의 개입을 최소화하여 시간을 절약하고 변동성과 오류를 줄입니다.
이 원고와 비디오는 이 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하기 위한 T 세포 형질도입(TCT) 공정에 대해 설명합니다. TCT 과정에는 CD4+/CD8+ T 세포 농축, 활성화, 바이러스 벡터를 사용한 transduction, 확장 및 수확이 포함됩니다. 이러한 단계의 순서와 타이밍을 허용하는 기능인 활동 매트릭스를 사용하여 TCT 프로세스를 광범위하게 사용자 지정할 수 있습니다. 당사는 현행 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하는 CAR-T 세포 제조에 대한 실무를 제공하고 임상시험용 신약(IND) 신청을 지원하는 필수 방출 테스트 및 전임상 실험에 대해 논의합니다. 임상 CAR-T 세포 제조를 위한 반자동 공정 사용의 타당성을 입증하고 장단점에 대해 논의합니다. 마지막으로, 소아 B세포 악성종양[NCT05480449]을 표적으로 하는 연구자 주도 임상시험을 이 제조 공정이 임상 환경에서 어떻게 적용될 수 있는지에 대한 예시로 설명합니다.
서론
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 입양 이식은 난치성 B 세포 악성 종양 1,2,3,4,5 환자를 치료하는 데 놀라운 효능을 보여주었습니다. 그러나 CAR-T 세포의 전통적인 제조 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 고도로 전문화된 단계를 수행하기 위해 고도로 훈련된 기술자가 필요합니다. 예를 들어, 자가 CAR-T 세포 제품의 기존 제조 공정에는 밀도 구배 원심분리, T 세포를 농축하기 위한 용출 또는 자기 분리, 멸균 플라스크에서 바이러스 벡터를 사용한 활성화 및 형질도입, 수확 및 제형 전에 바이오리액터에서의 팽창이 포함됩니다. 최근 이 프로세스를 부분적으로 자동화하는 것을 목표로 하는 다양한 시스템이 등장했습니다. 예를 들어, Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하, "프로세서"라 칭함)는 자동화된 방식으로 이러한 단계들 중 많은 것을 수행할 수 있는 자동화된 세포 처리 장치이다(6,7,8,9).<....
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프로토콜
모든 연구는 병원의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 기관 지침에 따라 수행되었으며, 모든 피험자는 임상시험의 맥락에서 수집된 데이터의 출판에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
참고: 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 CAR-T 제조 공정에 대한 높은 수준의 개요를 제공합니다. 나머지 섹션에서는 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 TCT 소프트웨어 버전 1.4를 사용하는 워크플로를 설명하며, 이는 이 문서 작성 시점의 현재 버전입니다. 다른 버전의 TCT 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 다를 수 있습니다.
1. 프로세스 타임라인 및 개요(표 1)
- 월요일(-1일차)에 비행 전 점검으로 절차를 준비합니다. 프로세서 및 기타 장비가 예상대로 작동하고 모든 시약 및 소모품을 전체 제조 실행에 사용할 수 있고 최신 상태인지 확인합니다.
- 0일째에 기계에 튜빙 세트를 설치합니다. 이전에 냉동 보존된 T 세포를 건식 수조에서 해동하고 멸균 용접을 통해 기기에 설치된 튜브 세트에 연결합니다.
참고: 이 프로토콜은 자가 T 세포가 성분채집술을 통해 수집되고, 동결 보존되고, 제조 시작까지 보관되었다고 가정합니다. 갓 채취한 T 세포를 사용....
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결과
NCT05480449 임상시험의 초기 3회 CAR-T 제조 실행 결과는 아래 표 3에 나와 있습니다. 출발 물질, 벡터, 배양 사이토카인 및 AB 혈청 농도는 각 실행에 대해 일관되게 유지되었습니다. 제품은 7일 또는 8일에 수확되었습니다. 하루 평균 세포 성장율은 46%(총 세포 수 증가)였으며, 이는 TCT 과정이 세포 증식을 촉진하는 데 효과적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 프로세서가 일관되고 재현 가능한 CAR-T 세포 산물을 생산할 수 있음을 시사합니다.
표 4에 요약된 최종 제품 테스트 결과는 CAR-T 세포가 품질 관리 표준을 통과했음을 보여줍니다. 세포 생존율은 88%에서 94% 사이였고 CD3 T 세포 순도는 89-93%였습니다. 중요한 것은 내독소, 마이코플라스마, 불임, 복제 가능한 렌티바이러스 및 잔류 백혈병 세포가 검출되지 않았다는 것입니다. 이러한 결과는 TCT 공정이 임상 사용을 위한 규제 기.......
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토론
CAR-T 세포 치료제는 B세포 및 기타 악성 종양에 대한 유망한 치료법으로 부상했습니다. 그러나 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 높은 비용, 노동 집약적인 생산, 오염 위험을 증가시키는 개방형 단계 등 몇 가지 한계가 있습니다. 최근에는 이러한 한계를 해결하기 위해 Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하 "프로세서")를 비롯한 여러 반자동 플랫폼이 등장했습니다. 이 원고에 설명된 프로세서에 통합된 T 세포 형질도입(TCT) 공정은 폐쇄형 시스템에서의 T 세포 농축, 활성화, 바이러스 형질도입, 배양 확장 및 수확을 포함합니다. 경쟁사의 자동 세포 처리기 플랫폼은 현재 널리 사용되지 않지만 배양 파라미터에 대한 공정 중 모니터링이 더 우수하거나, 유리한 장비 또는 재료 비용이 들거나, 설치 공간이 더 작아 전용 클린룸 공간 대신 생물 안전 작업대에서 사용할 수 있습니다. 주어진 응용 프로그램 및 환경에 가장 적합한 플랫폼을 선택하는 것이 중요합니다.
CAR-T .......
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공개 사항
S.K., S.G. 및 Y.W.는 Miltenyi Biotec으로부터 연구 지원을 받았습니다.
감사의 글
저자들은 이 작업에 대한 여러 개인과 조직의 기여에 감사를 표하고자 합니다. 세포 및 유전자 치료 실험실(Cell and Gene Therapy Laboratory)과 펜실베이니아 중개 및 상관 연구 실험실(Penn Translational and Correlative Studies Laboratory)은 공정 개발 및 IND 제출 준비에 귀중한 지원을 제공했습니다. 멜리사 바르게세(Melissa Varghese)와 아만다 디노피아(Amanda DiNofia)는 이 원고의 기초가 되는 IND 제출을 위한 프로세스 개발 및 준비에 기여했습니다. 이 연구는 필라델피아 아동 병원의 세포 및 유전자 치료 협력 단체의 가속 보조금의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 기술 및 연구 지원에 대해 Miltenyi Biotec에 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1 은 copyright © 2023 Miltenyi Biotec BV & Co. KG의 적용을 받습니다. 판권 소유.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12 x 75 붕규산 튜브 | Charles River | TL1000 | |
| 20mL 시약 백 | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50mL 원추형 튜브 | Fisher | 05-539-10 | |
| 150mL 전사 세트 | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000mL 전사 세트 | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | ||
| 알코올 준비 | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR 감지 시약 비오틴 | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| 셀로미터 참조 비드 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| 셀로미터 참조 비드 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| 셀로미터 참조 비드 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| 셀로미터 슬라이드 | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | CD4 시약 |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | CD8 시약 |
| CliniMACS PBS/EDTA 완충액 | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | 완충액 |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| 냉동 백 50mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| 냉동 바이알, 1.8mL | Nunc | 12565171N | |
| 냉동 바이알, 4.5mL | Nunc | 12565161N | |
| 인간 AB 혈청 | Valley Biomedical | Sterile 여과, 열 비활성화 | |
| 인간 혈청 알부민 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| 인간 혈청 알부민 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP 재조합 인간 IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | 사이토카인 |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | 활성화 시약 |
| MycoSeq Mycoplasma 감지 키트 | Life Technologies | 4460623 | |
| 바늘, 하이포더믹 14G | Medline | SWD200573 | |
| 바늘, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| 피펫 팁, 2-200 μ L, 개별 포장 | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet 팁, 50-1000 μ L, 개별 포장 | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | 전해질 솔루션 |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | 튜빙 세트 |
| 멸균 필드 | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| 주사기 1 mL | BD | 309628 | |
| 주사기 10 mL | BD | 302995 | |
| 주사기 3 mL | BD | 309657 | |
| 주사기 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP 매체 | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | 매체 |
| 삼중 샘플링 어댑터 | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| 바이러스 벡터 | CHOP 임상 벡터 코어 | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety 캐비닛 | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | 프로세서 |
| 제어 속도 냉동고 | 대패 / Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler 밸런스 | 메틀러 | ||
| 냉장 원심분리기 | Thermo Fisher | ||
| 냉장 원심분리기 | Fisher Sci | ||
| SCD 멸균 튜빙 용접기 | Terumo | ||
| Sebra 튜브 실러 | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | 건식 해동 장치 | |
| XN-330 혈액학 분석기 | Sysmex |
참고문헌
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al.
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재인쇄 및 허가
