Aquí, presentamos un método de purificación de afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que es simple, económico y eficiente.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus
En este artículo
Resumen
Resumen
La enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) es un nuevo agente fibrinolítico que puede activar el plasminógeno en plasmina y degradar la fibrina directamente, mostrando grandes ventajas sobre los agentes trombolíticos tradicionales. Sin embargo, debido a la falta de información estructural, todos los programas de purificación para sFE se basan en purificaciones por cromatografía de varios pasos, que son demasiado complicadas y costosas. Aquí, se desarrolla por primera vez un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en una estructura cristalina de sFE; incluye la preparación de la muestra cruda y la columna de cromatografía de afinidad de la matriz lisina/arginina-agarosa, la purificación de afinidad y la caracterización del sFE purificado. Siguiendo este protocolo, un lote de sFE se puede purificar en 1 día. Además, la pureza y la actividad del sFE purificado aumentan a 92% y 19,200 U/mL, respectivamente. Por lo tanto, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de sFE. El desarrollo de este protocolo es de gran importancia para la utilización posterior de sFE y otros agentes similares.
Introducción
La trombosis es una amenaza importante para la salud pública, especialmente después de la pandemia mundial de Covid-19 1,2. Clínicamente, muchos activadores del plasminógeno (AP), como el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) y la uroquinasa (Reino Unido), se han utilizado ampliamente como fármacos trombolíticos. Los PA pueden activar el plasminógeno de los pacientes en plasmina activa para degradar la fibrina. Así, su eficiencia trombolítica está fuertemente restringida por el estado plasminógeno de los pacientes 3,4. Los agentes fibrinolít....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación
- Tratamiento de la muestra
- Diseccionar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) y recoger el intestino y su líquido interno.
- Añadir 300 ml de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneización (1.000 rpm, 60 s).
- Congelar-descongelar el homogeneizado 3x.
- Centrifugar la muestra (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) y recoger el sobrenadante. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso posterior.
- Precipitación de proteínas
- Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Siguiendo este protocolo, se extrajeron lisados tisulares crudos, se construyeron columnas de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y matriz de lisina-agarosa, se obtuvo sFE purificado y se midió la pureza y actividad fibrinolítica del sFE purificado mediante placas SDS-PAGE y fibrina, respectivamente.
Después de la centrifugación, el sobrenadante recogido era un líquido viscoso de color canela transparente. La precipitación comenzó cuando este sobrenadante se mezcló con una .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia génica exacta de sFE, la sFE utilizada actualmente se extrajo de S. nudus14 fresco. Además, los procedimientos de purificación de sFE descritos en la literatura fueron complicados y costosos, ya que se basaron en algunas características generales de sFE, como el peso molecular, el punto isoeléctrico, la fuerza iónica y la polaridad15,16. Hasta la fecha no se ha informado de ningú.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
de imágenes de quimioluminiscencia SANYO BT-100 QITE Centrífuga refrigerada de escritorio DHG Series Horno de calentamiento y secado precisión Oscilador de vórtice sartorio Sistema de electroforesis vertical Tubo de centrífuga Tubo de centrífuga Tubo de centrífuga Tubo de centrífuga NEST Placa de cultivo Membrana de filtro NEST Punta de pipeta Punta de pipeta Punta de pipeta Papel indicador especial Unidad de (15 mL 3 KDa)Unidad de filtro ultracentrífugo Millipore SSS indicador de pH universal Millipore
Sulfato de amonio SINOPHARM Matriz
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 30% Acrilamida-Bisacrilamida (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoetanol | Solarbio | ||
| Agarosa G-10 | Biowest | ||
| Persulfato de amonio | SINOPHARM | ||
| Arginina-Sepharose 4B | Solarbio | Matriz de arginina-agarosa | |
| Azul de bromoxilenol (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Ácido clorhídrico | SINOPHARM | ||
| Kinasa | RHAWN | ||
| Lisina-Sepharose 4B | Solarbio | de lisina-agarosa | |
| N,N,N',N'-Tetrametilemilendiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Marcador de proteínas de color preteñido (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Cloruro de sodio | SINOPHARM | ||
| Dodecil sulfonato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Hidróxido de | sodioSINOPHARM | ||
| Trombina | Meilunbio | ||
| Tris (Hidroximetil) Aminometano | Solarbio | ||
| Tris (Hidroximetil) Clorhidrato de aminometano | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Pura Sistema de purificación GE puro | |||
| Esterilizador automático de vapor de presión vertical MLS-3750 | Sistema | ||
| Bomba de flujo constante GE | |||
| Incubadora de temperatura constante | JINGHONG | ||
| 3-30KS | SIGMA | ||
| DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Homogeneizador de vidrio eléctrico DY89-II | SCIENTZ | ||
| Balanza analítica electrónica | DENVER | ||
| Baño de agua electrotermostático DK-S12 | SENXIN | ||
| Agitador de decoloración horizontal | Kylin-Bell | ||
| Máquina de hielo AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Limpiador ultrasónico | ShuMei | ||
| Agitador magnético | Zhi wei | ||
| Micro Centrífuga Refrigerada H1650-W | Cence | ||
| Horno de microondas | Galanz | ||
| Milli-Q Referencia | Millipore | ||
| Pipeta | Thermo Fisher Scientific | ||
| Medidor de pH de escritorio | de | ||
| de tamaño pequeño | Kylin-Bell | ||
| Bio-Rad | |||
| Material consumible | |||
| 200 y micro; Tubo de PCR L (200 y micro; L) | Axygene | ||
| (1,5 mL) | Biosharp | ||
| (5 mL) | Biosharp | ||
| (50 mL) | |||
| (7 mL) | Biosharp | ||
| (60 mm) | |||
| (0,22 y micro; m) | Millex GP | ||
| Parafilm Bemis | |||
| (1 mL) | KIRGEN | ||
| (10 µ L) | Axygene | ||
| (200 y micro; L) | Axygene | ||
| filtro ultracentrífugo TZAKZY | |||
| (4 mL 3 KDa) | Reactivo | ||
Referencias
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
