Summary
Een langdurige conserveringsmethode voor Drosophila-stammen als alternatief voor de frequente overdracht van volwassen vliegen naar flesjes met vers voedsel is zeer wenselijk. Dit protocol beschrijft de cryopreservatie van Drosophila primordiale kiemcellen en de heropleving van stammen via hun transplantatie naar agametische gastheerembryo's.
Abstract
Drosophila-stammen moeten in stand worden gehouden door de frequente overdracht van volwassen vliegen naar nieuwe injectieflacons. Dit brengt het gevaar met zich mee van mutatieverslechtering en fenotypische veranderingen. De ontwikkeling van een alternatieve methode voor langdurige bewaring zonder dergelijke veranderingen is daarom absoluut noodzakelijk. Ondanks eerdere succesvolle pogingen is cryopreservatie van Drosophila-embryo's nog steeds niet van praktisch nut vanwege de lage reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we een protocol voor cryopreservatie van primordiale kiemcellen (PGC) en stamopwekking via transplantatie van gecryopreserveerde PGC's in agametische Drosophila melanogaster (D. melanogaster) gastheerembryo's. PGC's zijn zeer doorlaatbaar voor cryoprotectieve middelen (CPA's), en ontwikkelings- en morfologische variatie tussen stammen is minder problematisch dan bij cryopreservatie van embryo's. Bij deze methode worden PGC's verzameld uit ongeveer 30 donorembryo's, na CPA-behandeling in een naald geladen en vervolgens gecryopreserveerd in vloeibare stikstof. Om van donoren afgeleide gameten te produceren, worden de gecryopreserveerde PGC's in een naald ontdooid en vervolgens gedeponeerd in ongeveer 15 agametische gastheerembryo's. Met dit protocol werd een frequentie van ten minste 15% vruchtbare vliegen bereikt, en het aantal nakomelingen per vruchtbaar paar was altijd meer dan genoeg om de oorspronkelijke stam nieuw leven in te blazen (het gemiddelde aantal nakomelingen was 77,2 ± 7,1), wat wijst op het vermogen van gecryopreserveerde PGC's om kiembaanstamcellen te worden. Het gemiddelde aantal vruchtbare vliegen per naald was 1,1 ± 0,2, en 9 van de 26 naalden produceerden twee of meer vruchtbare nakomelingen. Het bleek dat 11 naalden voldoende zijn om 6 of meer nakomelingen te produceren, waarin waarschijnlijk ten minste één vrouwtje en één mannetje zijn opgenomen. De agametische gastheer maakt het mogelijk om de soort snel nieuw leven in te blazen door simpelweg nieuw opgekomen vrouwelijke en mannelijke vliegen te kruisen. Bovendien hebben PGC's het potentieel om te worden gebruikt in genetische manipulatietoepassingen, zoals genoombewerking.
Introduction
Het in stand houden van Drosophila-stammen door de overdracht van volwassen vliegen naar nieuwe voedselflesjes resulteert onvermijdelijk in de accumulatie van mutaties en epigenetische veranderingen in de loop van de tijd. De ontwikkeling van een alternatieve methode voor het langdurig in stand houden van Drosophila-stammen zonder dergelijke veranderingen is absoluut noodzakelijk, vooral voor referentiestammen waarin het hele genoom moet worden gehandhaafd. Er zijn verschillende succesvollepogingen beschreven om Drosophila-embryo's of eierstokken te cryopreservatie 1,2,3. Helaas zijn ze nog steeds niet van praktisch nut vanwege de lage reproduceerbaarheid. Embryo's in een vroeg stadium hebben inderdaad een laag overlevingspercentage na cryopreservatie vanwege hun hoge dooiergehalte, wat de permeatie en diffusie van cryoprotectieve middelen (CPA) belemmert 2,3. De CPA-permeabiliteit wordt ook ernstig beperkt door de wasachtige lagen van embryo's in een laat stadium. Het is moeilijk en tijdrovend om een stamspecifieke tijdsperiode te vinden waarin embryo's een hoge overlevingskans en een dunnere waslaag hebben. Onlangs hebben Zhan et al.4 methoden verbeterd voor embryopermeabilisatie, CPA-laden en vitrificatie en met succes gecryopreserveerde embryo's van meerdere stammen. De methoden zijn echter niet gemakkelijk toe te passen omdat de levensvatbaarheid van embryo's na permeabilisatie meestal slecht is. Daarom zijn verdere verbetering en ontwikkeling van alternatieve benaderingen nog steeds nodig. Methoden met cryopreservatie van primordiale kiemcellen (PGC's) zijn een alternatieve benadering voor het langdurig in stand houden van Drosophila-stammen.
PGC-transplantatie (ook wel poolcel genoemd) is gebruikt om kiembaanchimaera's te genereren, vooral vrouwtjes, om processen te bestuderen zoals maternale effecten van zygote letale mutaties en geslachtsbepaling van geslachtscellen 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC's zijn veel kleiner dan embryo's en zijn waarschijnlijk zeer doorlaatbaar voor de meeste cryoprotectanten. Bovendien is ontwikkelings- en morfologische variatie tussen stammen minder problematisch, en een agametische gastheer maakt snel herstel van hele genomen mogelijk. We hebben onlangs een nieuwe methode van PGC-cryopreservatie13 ontwikkeld, die de anders onvermijdelijke genetische en epigenetische veranderingen in Drosophila-stammen voorkomt. Hier presenteren we het gedetailleerde protocol.
Deze cryopreservatiemethode vereist specifieke expertise op het gebied van PGC-behandeling en -instrumentatie. Hoewel een stapsgewijze aanpak een efficiënte oplossing kan zijn voor degenen die er niet bekend mee zijn, kan het ongeschikt zijn voor kleine laboratoria vanwege instrumentatievereisten. Dit PGC-cryopreservatieprotocol kan gemakkelijker worden aangepast voor gebruik met verschillende Drosophila-soorten en verschillende insectensoorten dan cryopreservatieprotocollen voor embryo's vanwege kleinere ontwikkelings- en morfologische verschillen. PGC's kunnen mogelijk ook worden gebruikt in genetische manipulatietoepassingen, zoals genoombewerking 14,15,16. Samenvattend kan deze methode worden gebruikt in voorraadcentra en andere laboratoria om vliegen- en andere insectenstammen gedurende langere tijd zonder veranderingen in stand te houden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de apparatuur
- Micromanipulatorsysteem: Stel een micromanipulatorsysteem samen om cellen te verzamelen en te transplanteren (Figuur 1A).
- Glasplaatjes uit de PGC-collectie (Figuur 2A)
- Om heptaanlijm te bereiden, knipt u ongeveer 30 cm lange dubbelzijdige tape af en laat u deze een nacht weken in 7 ml technische (normale) heptaanoplossing.
- Teken twee parallelle referentielijnen voor de uitlijning van het embryo op de achterkant van een objectglaasje.
- Smeer druppels van bovenstaande heptaanlijm op het objectglaasje (aan de kant zonder de lijnen) met behulp van een pasteurpipet. Laat het oppervlak van de dia aan de lucht drogen totdat het wit wordt.
- Herhaal het toevoegen en verspreiden van heptaanlijmdruppels en droog het glaasje opnieuw.
NOTITIE: De lijm voorkomt dat vloeibare oplossingen zich over het vlakke oppervlak verspreiden en maakt het gemakkelijker om waterige oplossingen in een naald te laden. - Om frames voor embryobaden te maken, plakt u drie lagen standaard vinyltape van 0,2 mm dik, zoals isolatietape, op een snijplank. Knip de tape in rechthoeken van 1,5 cm breed. Knip vervolgens alle drie de lagen tape weg, zodat er een frame van 2 tot 3 mm overblijft.
OPMERKING: Na het uitlijnen van embryo's wordt een embryopoolframe aangebracht om een pool voor embryo's te vormen.
- Transplantatie naalden
OPMERKING: Alle in de handel verkrijgbare naalden ten tijde van dit onderzoek waren te smal of te breed voor PGC-cryopreservatie.- Maak een naald met behulp van een glazen capillair en een trekker. We gebruiken een NARISHIGE PN-31-trekker met het verwarmingsniveau op 85.0-98.4, het hoofdniveau van de magneet op 57.8 en het subniveau van de magneet op 45.0.
- Om een naald te maken met een wanddikte van ongeveer 1 μm en een punt van ongeveer 200 μm lang met een binnendiameter van 10-12 μm, polijst u de naaldpunt in het volgende proces in drie stappen (Figuur 3). Slijp eerst de naaldpunt onder een hoek van 30° met een snelheid van 780 tpm totdat de punt een binnendiameter heeft van 10-12 μm. Deze eerste maalstap duurt ongeveer 1 uur.
NOTITIE: Om te voorkomen dat de naaldpunt breekt, draait u eerst de slijpsteen en beweegt u de naald vervolgens voorzichtig naar beneden op de slijpsteen. - Teken een lijn op de bovenkant van de naald om de gewenste hoek te volgen. Draai de naald 90° tegen de klok in en polijst hem opnieuw met een snelheid van 180 tpm. Dit duurt ongeveer 5 min.
- Draai de naald 45° met de klok mee en polijst hem gedurende één seconde met een snelheid van 180 tpm.
- Plaats een verzamelglaasje met een druppel chroomzuurmengsel (LET OP: giftig) op de microscooptafel. Bevestig de naald aan de capillaire houder (Figuur 1D) in een hoek van 10°-13° ten opzichte van het schuifoppervlak, beweeg de naald voorzichtig naar beneden en dompel de punt onder in het chroomzuurmengsel.
- Door aan de zuiger te trekken en te duwen (Figuur 1B), laadt en laat u de oplossing meerdere keren mechanisch uit de naald lopen om glasresten in de naald te verwijderen. Zorg ervoor dat u ook de buitenmuur schoonmaakt.
- Was de binnen- en buitenkant van de naald twee keer met gedestilleerd water om het chroomzuur volledig te verwijderen.
2. Verzameling en cryopreservatie van PGC's
- Embryo's verzamelen
- Breng een passend aantal vliegen van de betreffende donorstam (ongeveer 450 voor elk geslacht voor de embryoverzamelbeker) over in een embryoverzamelbeker met een embryo-verzamelplaat (figuur 1E) en broed ze uit bij 25 °C. We gebruiken meestal oudervliegen van 3 tot 5 dagen oud die onder minder drukke omstandigheden bij kamertemperatuur (23-25 °C) worden gekweekt.
- Voer twee pre-collecties van 30 minuten uit en gooi alle gelegde eieren weg. Omdat vrouwtjes bevruchte eieren die zich in de eileider ontwikkelen kunnen behouden, is deze stap nodig om het leggen van eieren in stap 2.1.3 te synchroniseren (Figuur 4).
- Na de twee pre-collecties, verzamel embryo's gedurende 50 minuten en incubeer de verzamelde embryo's vervolgens in een bevochtigde kamer bij 25 °C om de embryo's te laten ontwikkelen tot het blastodermstadium (vroeg stadium 517). De incubatietijd is gewoonlijk 100 min, maar kan worden verlengd tot 120 min, afhankelijk van de belasting (Figuur 4).
NOTITIE: Een bevochtigde kamer wordt gemaakt door een vochtige papieren handdoek op de bodem van een plastic doos te plaatsen en deze voor gebruik met een waternevel te besproeien. In embryo's in een vroeg stadium 5 is de PGC-vorming voltooid, maar somatische cellularisatie niet. Het exacte stadium van een embryo wordt in stap 2.4 onder een samengestelde microscoop bepaald.
- Dechorionerende embryo's
- Deponeer een druppel gedestilleerd water op een roestvrijstalen zeef (150 maaswijdte, 109 μm opening, 60 μm draaddiameter; Figuur 1F). Verzamel met een tang embryo's van de embryo-verzamelplaat en leg ze in de waterdruppel.
- Druk vloeipapier van onderaf tegen de zeef om het water op te nemen. Voeg druppeltjes verse 5% (als Cl) natriumhypochlorietoplossing toe aan de embryo's en tik continu gedurende 10 s op de zeef.
- Was de embryo's door ze direct met gedestilleerd water te bespatten en druk papieren zakdoekjes van onderaf tegen de zeef om het water op te nemen. Herhaal deze stap 3x.
- Uitlijnen van gedechorioneerde embryo's
- Gebruik onder een stereomicroscoop een pincet om embryo's terug te plaatsen. Lijn de gedechorioneerde embryo's in twee rijen uit op een PGC-objectglaasje langs de twee referentielijnen (Figuur 2A). De embryo's zijn georiënteerd met hun voorkant naar rechts (de te manipuleren kant) en ventrale kant naar boven.
OPMERKING: Deze stap moet in 20 minuten worden voltooid, waarbij we gewoonlijk ongeveer 40 embryo's uitlijnen. - Bevestig een embryopoolframe rond de embryo's op het glasplaatje van de PGC-collectie. Breng 1 μL CPA-oplossing (1x Ephrussi-Beadle Ringer-oplossing, EBR, met 20% ethyleenglycol en 1 M sucrose; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 en 10 mM Hepes bij pH 6,9) aan op twee afzonderlijke plaatsen in het gebied dat door het frame wordt omsloten en vul het zwembad met siliconenolie om uitdroging van de embryo's te voorkomen (Figuur 2A).
OPMERKING: Om de CPA-oplossing te bereiden, lost u 10,26 g sacharose volledig op in ongeveer 20 ml gedestilleerde H2O met 3 ml 10 x EBR-oplossing. Voeg 6 ml ethyleenglycol toe en voeg vervolgens gedistilleerd H2O tot 30 ml toe. Filtreer de oplossing na grondig mengen door een wegwerpmembraan van 0,22 mm.
- Gebruik onder een stereomicroscoop een pincet om embryo's terug te plaatsen. Lijn de gedechorioneerde embryo's in twee rijen uit op een PGC-objectglaasje langs de twee referentielijnen (Figuur 2A). De embryo's zijn georiënteerd met hun voorkant naar rechts (de te manipuleren kant) en ventrale kant naar boven.
- PGC's verzamelen
- Plaats het objectglaasje uit de PGC-collectie van stap 2.3.2 op de tafel van een microscoop die is uitgerust met een micromanipulatorsysteem. Bevestig de naald aan de capillaire houder en breng het eerste embryo in de linkerrij en de naaldpunt in hetzelfde brandpuntsvlak. Laad siliconenolie in de naald gedurende 2-3 s.
- Begin met het verzamelen van PGC van embryo's in de linkerrij. Gebruik een 20x objectieflens om de naaldpunt voorzichtig naar het oppervlak van het voorste uiteinde van het embryo te bewegen en het embryo naar het achterste uiteinde te penetreren, niet door de naald te bewegen, maar door de microscooptafel te verplaatsen.
- Wanneer de punt van de naald het achterste uiteinde bereikt, trekt u de naald iets terug en laat u de dooier in de naald net binnen de somatische cellaag volledig ontsnappen.
- Terwijl u de druk in de naald constant houdt, verplaatst u de naaldpunt naar de PGC's net binnen de achterpool en laadt u de PGC's voorzichtig, maar zonder veel tijd te kosten.
- Trek de naald snel uit het embryo en laat dooier en andere verontreinigingen uit de naald in het siliconenoliebad lopen, waarbij de PGC's in de naald blijven. Laad vervolgens schone siliconenolie uit het zwembad.
- Herhaal stap 2.4.2 tot en met 2.4.5 voor de andere embryo's in de linkerrij. Voordat u PGC's van een nieuw embryo verzamelt, deponeert u zoveel mogelijk van de siliconenolie die in stap 2.4.5 is geladen in de somatische cellaag terwijl u geladen PGC's in de naald houdt. Dit zorgt ervoor dat nieuw geladen PGC's naast de eerder verzamelde PGC's liggen zonder dat er tussenmateriaal tussen zit.
- Na het voltooien van de PGC-verzameling van embryo's in de linkerrij, scheidt u PGC's zoveel mogelijk van de dooier en andere verontreinigingen. Om dit te bereiken, deponeert u alle PGC's in de naald op het oppervlak van een embryo en verwijdert u eventuele dooier of andere verontreinigingen naar een ander naburig embryo.
- Verzamel vervolgens PGC's van embryo's in de rechterrij. Combineer de PGC's die zijn verzameld uit de rechter- en linkerrij.
- Cryoprotectief middel (CPA) toepassen op PGC's
- Nadat u de naald met CPA in één druppel hebt gewassen, laadt u verse CPA in een andere druppel in de naald en voegt u CPA toe aan de PGC's die op het embryo zijn afgezet. Het volume van de CPA moet gelijk zijn aan dat van de PGC's.
- Verwijder zoveel mogelijk CPA uit het cluster van PGC's 1-2 s na de toevoeging van CPA. PGC's krimpen iets en worden direct na CPA-toevoeging vierkant van vorm.
- Maak de naald leeg en laad vervolgens siliconenolie gedurende 5 s of langer. Laad alle verzamelde PGC's en laad vervolgens opnieuw siliconenolie gedurende 5 s of langer. PGC's zijn nu ingeklemd tussen twee lagen siliconenolie (Figuur 2B).
NOTITIE: Het is belangrijk om zoveel mogelijk dooier, CPA en andere verontreinigingen te verwijderen.
- Cryopreservatie van PGC's
- Open de driewegkraan (Figuur 1C) en maak vervolgens de naald los van de micromanipulator. Dep de olie van het oppervlak van de naald met zacht tissuepapier. Raak de punt van de naald niet rechtstreeks aan met het weefsel.
- Bevestig de naald aan een naaldhouder en vergrendel deze op zijn plaats aan de basis met vinyltape (Figuur 1H). Plak een etiket op de houderbuis.
- Vries de houder met de naald naar beneden door hem onder te dompelen in vloeibare stikstof. Laat de houder pas los als de vloeistof niet meer uit het rek bruist.
- Bewaar de houder in een opslagtank voor vloeibare stikstof in het gebied van de vloeibare fase, niet in het gebied van de dampfase.
3. PGC's ontdooien en verplanten
- Verzamelen, dechorioneren en uitlijnen van embryo's van agametische gastheervliegen
- Verzamel en dechorioneer embryo's van agametische gastheervliegen volgens stap 2.
- Lijn de stadium 5 agametische gastheerembryo's uit op een glazen objectglaasje voor transplantatie. Oriënteer deze keer echter het achterste naar rechts (de te manipuleren kant) en ventrale naar boven (Figuur 5). Zet ongeveer 30 embryo's in twee rijen op een rij in 20 minuten.
- Gebruik tijdens het uitlijnen van embryo's een luchtbevochtiger gedurende 2-10 minuten als de luchtvochtigheid in de kamer dit vereist (tabel 1). De ideale luchtvochtigheid is 30% tot 40%, maar dit kan variëren afhankelijk van de thermische omstandigheden.
- Ontdooien en transplanteren van PGC's in gastheerembryo's
- Om gecryopreserveerde PGC's snel te ontdooien, schuift u de houder met de naald in 1x EBR-oplossing op kamertemperatuur met de naald naar beneden gericht en houdt u deze 10 s ondergedompeld.
- Plaats het objectglaasje voor transplantatie op de tafel van een microscoop. Bevestig de gevriesdroogde naald aan de capillaire houder en breng het eerste embryo in de linkerrij en de naaldpunt in hetzelfde brandpuntsvlak.
- Gebruik een 20x objectieflens om de naaldpunt voorzichtig naar het oppervlak van het achterste uiteinde van het embryo te bewegen.
- Prik voorzichtig in de buitenkant van elk embryo en zorg ervoor dat ze langzaam terugkeren naar hun oorspronkelijke vorm. Het prikken zal bevestigen dat de inwendige druk van het embryo niet te hoog of te laag is.
- Beweeg de naald voorzichtig en penetreer een embryo vanaf de achterpool.
- Breng voorzichtig ongeveer 10-20 PGC's aan net binnen de achterpool, precies tussen het vitellinemembraan en de somatische cellaag van het embryo. Vermijd het afzetten ervan in de somatische cellaag. Als de perivitellinevloeistof uit het embryo lekt, zuig dan de gelekte vloeistof in de naald en verwijder deze.
- Trek de naald terug uit het embryo. Herhaal stap 3.2.5 en 3.2.6 voor de volgende embryo's.
4. Incubatie van embryo's en herstel van donorstammen
- Verwijder alle embryo's die geen getransplanteerde PGC's krijgen en incubeer de resterende embryo's in een bevochtigde kamer (figuur 1G) bij 25 °C.
- Gebruik 24 uur of langer na de transplantatie en zo snel mogelijk na het uitkomen een tang om de uitgekomen larven op te pakken en over te brengen naar standaard Drosophila-voedselflesjes en te incuberen bij 25 °C.
- Om de soort nieuw leven in te blazen, kruis je nieuw opgekomen vrouwtjes en mannetjes (Figuur 6).
OPMERKING: Agametische gastheren maken het mogelijk om het hele genoom in één keer te herstellen zonder te kruisen met balancer-chromosoomstammen. Het naast elkaar bestaan van agametische mannetjes in een injectieflacon doet er niet toe, omdat vrouwtjes, zelfs als ze met hen gepaard zijn, geen langdurige reacties na de paring vertonen, waaronder verminderde ontvankelijkheid voor remating18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De efficiëntie van gecryopreserveerde PGC-transplantatie is gerapporteerd door Asaoka et al.13 en wordt gegeven in tabel 2 voor transplantatie van PGC's die gedurende 1 dag of langer zijn ingevroren in vloeibare stikstof. Het uitkomstpercentage was 168/208 getransplanteerde embryo's (80.8%) en de levensvatbaarheid van embryo tot volwassene was 87/208 (41.8%). De frequentie van vruchtbare vliegen bedroeg 28/87 (32,2%). Deze frequentie verschilde niet tussen PGC's die gedurende 8 tot 30 dagen werden gecryopreserveerd en die gedurende 31-150 dagen werden gecryopreserveerd (20/57 vs. 8/30, G' = 0,63, p >0,1, d.f. = 1). Het gemiddelde aantal nakomelingen per paar was 77,2 ± 7,1 (n = 18, 28-122), wat wijst op het vermogen van gecryopreserveerde PGC's om kiembaanstamcellen te worden. Van de 26 naalden produceerden er 10 geen vruchtbaar nageslacht, 7 naalden produceerden 1 vruchtbaar nageslacht, 7 naalden produceerden 2 vruchtbaar nageslacht en 2 naalden produceerden 3 of 4 vruchtbaar nageslacht. Het gemiddelde aantal vruchtbare vliegen per naald was 1,1 ± 0,2. Op basis van deze gegevens, met een betrouwbaarheid van 95%, zijn 11 naalden voldoende om 6 of meer nakomelingen te produceren, waaronder waarschijnlijk ten minste één vrouwtje en één mannetje.
In de bovenstaande experimenten gebruikten we embryo's die ovo-A-mRNA tot expressie brachten in PGC's (nano's>ovo-A, OvoA_OE embryo's) als agametische gastheer. Van de 669 F1-vrouwtjes en 720 F1-mannetjes geproduceerd uit getransplanteerde nanos>ovo-A-paren, was er geen ontsnapping die was afgeleid van de gastheer-PGC's. Verschillende oskar (osk) mutanten zijn ook temperatuurgevoelige agametische20,21. Omdat een osk-mutant met een hoge homozygote levensvatbaarheid en het agametische fenotype niet langer beschikbaar is, hebben we de osk[8] missense-mutant20 opnieuw gemaakt door middel van CRISPR/Cas9-geassisteerde genoombewerking. Deze vliegen waren volledig agametisch (0 ontsnappers op 230 vrouwtjes en 192 mannetjes) bij 25 °C, maar een paar ontsnappers kwamen tevoorschijn bij 23 °C (1 op de 248 vrouwtjes en 1 op de 290 mannetjes). nano's>ovo-A worden dus aanbevolen als agametische gastheerembryo's. Zowel UASp-ovo-A als nanos-Gal4 aandelen13 zullen binnenkort verkrijgbaar zijn bij het KYOTO Drosophila Stock Center.
Figuur 1: Benodigde apparatuur. (A) Een micromanipulatorsysteem om cellen te verzamelen en te transplanteren. i) omgekeerde microscoop, ii) mechanische micromanipulator, iii) spuit, iv) capillaire houder, v) driewegkraan, vi) luchtbevochtiger en vii) stereomicroscoop. (B) Een injectiespuit. (C) Een driewegkraan en siliconenslangen verbinden een spuit en een capillaire houder. (D) Een naald en een capillaire houder zijn bevestigd aan een micromanipulator. (E) Een embryo-verzamelbeker met een embryo-verzamelplaat (6 cm diameter, 7,7 cm hoog). (F) Een roestvrijstalen zeef. (G) Een recipiënt die wordt gebruikt als vochtige kamer met een glasplaatje. Om de luchtvochtigheid op peil te houden, legt u nat papier op de bodem en sluit u het deksel. (H) Een naaldhouder met een naald voor cryopreservatie. (I) Een opbergrek voor cryopreservatie en een doos met naalden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een objectglaasje uit de PGC-collectie en een cryopreservatienaald. (A) Een objectglaasje met een insulaire kiemcelverzameling (PGC) dat met lijm is bedekt. Gedechorioneerde embryo's zijn uitgelijnd in twee rijen en georiënteerd met hun voorkant naar rechts (de te manipuleren kant) en ventrale kant naar boven. Er wordt een embryopoolframe aangebracht, twee druppels cryoprotectieve middelen (CPA)-oplossing worden afgezet en het zwembad wordt gevuld met siliconenolie. (B) Een naald moet een zo klein mogelijke hoeveelheid dooier en andere verontreinigingen bevatten. PGC's worden ingeklemd tussen twee lagen siliconenolie wanneer ze worden ingevroren in vloeibare stikstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het maken van de naald. Polijstmethode in drie stappen om een naald te maken met een geschikte gatgrootte en een scherpe punt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Regeling voor het verzamelen van embryo's. Na twee voorophalingen halen we meestal drie of vier keer per dag op. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Uitlijning van het gastheerembryo. Uitlijning van gastheerembryo's op een glasplaatje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Een overzicht van de PGC-cryopreservatiemethode. Een overzicht van alle stappen die zijn gevolgd om de cryopreservatie van primordiale kiemcellen (PGC) uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Luchtvochtigheid in de kamer | |||
| < 30% | ~ 30% | > 30% | |
| Gastheerembryo's uitlijnen (~20 min) |
Gebruik een luchtbevochtiger gedurende 2 - 10 minuten | Gebruik een luchtbevochtiger met tussenpozen gedurende 1 minuut | Gebruik geen luchtbevochtiger |
| Donor-PGC's ontdooien | Niet van toepassing | Niet van toepassing | Niet van toepassing |
| PGC's aan de lucht laten drogen | Sla deze stap over | Sla deze stap over | 5 min |
| Breng siliconenolie aan | Niet van toepassing | Niet van toepassing | Niet van toepassing |
| PGC's transplanteren | Niet van toepassing | Niet van toepassing | Niet van toepassing |
| Al deze stappen moeten in 50 minuten worden voltooid. | |||
Tabel 1: Drogen van embryo's tijdens het uitlijnen van de embryo's en het ontdooien van PGC.
| Donorstam | Cryopreservatie periode | Aantal getransplanteerde embryo's (A) | Aantal uitgekomen larven (B) (uitkomst, B/A) |
Aantal gesloten volwassenen (C) (levensvatbaarheid van ei tot volwassene, C/A) |
Aantal vruchtbare volwassenen (D) (frequentie van vruchtbare vliegen, D/C) |
| M17 | 8 - 30 dagen | 134 | 108 (80.6%) |
57 (42.5%) |
20 (35.1%) |
| M17 | 31 - 150 dagen | 74 | 60 (81.1%) |
30 (40.5%) |
8 (26.7%) |
| M17: taxus; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1] | |||||
Tabel 2: Efficiëntie van gecryopreserveerde PGC-transplantatie. Deze tabel is gewijzigd van13. Alle gegevens zijn afkomstig van agametische hosts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een kritische factor voor succes bij PGC-cryopreservatie en -opwekking is het gebruik van goede embryo's. Jonge vrouwtjes (bijv. 3 tot 5 dagen oud) moeten worden gebruikt voor het verzamelen van embryo's. Zowel donor- als gastheerembryo's worden beoordeeld door middel van microscopische inspectie, en alleen die in het blastodermstadium (stadium 5) worden gebruikt12. Voor PGC-verzameling richten we meestal ongeveer 40 donorembryo's uit in een periode van 20 minuten en verzamelen we PGC's van ongeveer 30 embryo's in vroeg stadium 5; Oudere en defecte embryo's worden niet gebruikt. Na cryopreservatie en ontdooiing moeten PGC's hun vorm behouden; PGC's scheuren bij mislukte conservering. Gastheerembryo's moeten zich ook in stadium 5 bevinden en een matige inwendige druk hebben; Embryo's moeten langzaam terugkeren naar hun oorspronkelijke vorm na voorzichtig porren. Te veel en onvoldoende gedroogde embryo's zullen zich na transplantatie niet normaal ontwikkelen. Omdat heteroseksuele transplantatie van PGC's geen gameten produceert in Drosophila 5,10, is de kans groter dat transplantatie van PGC's van meerdere donorembryo's in gastheerembryo's vruchtbare volwassenen oplevert. Hiervoor verzamelen we meestal PGC's van ongeveer 30 embryo's per naald.
Als cryoprotectanten probeerden we ethyleenglycol, dimethylsulfoxide en glycerol samen met sucrose in verschillende concentraties. We hebben vastgesteld dat EBR met 20% ethyleenglycol en 1 M sucrose de beste13 is; het gebruik van verschillende cryoprotectanten kan echter de bewaring van PGC's verbeteren22.
Deze cryopreservatiemethode vereist gespecialiseerde vaardigheden in het hanteren van PGC's, en er is ongeveer 6 weken training nodig om PGC's comfortabel te verzamelen en te transplanteren. Om de vaardigheidsvaardigheid te beoordelen en te verbeteren, kan dit worden onderverdeeld in zes trainingsstappen: 1) het uitlijnen van embryo's op een glasplaatje, 2) het besturen van een manipulator, 3) het transplanteren van PGC's van een embryo in een ander embryo zonder cryopreservatie, 4) het transplanteren van PGC's van 10 of meer embryo's in 5 tot 10 embryo's, 5) het transplanteren van PGC's na het aanbrengen van CPA, en 6) het transplanteren van PGC's na vriesontdooien. Elke stap kan 1 week duren. De kortetermijndoelen bij stap 3 zijn een uitkomstpercentage van 40%, de levensvatbaarheid van embryo tot volwassen van 10%-20% en een frequentie van vruchtbare vliegen van 20%.
PGC-cryopreservatie vereist dure instrumenten en hoogopgeleid personeel. Daarom is het mogelijk dat deze methode niet door veel laboratoria wordt toegepast. De huidige PGC-methode heeft echter een aantal belangrijke aspecten. Ten eerste zijn PGC's veel kleiner dan embryo's en zijn ze zeer doorlaatbaar voor cryoprotectanten. Daarentegen wordt de permeabiliteit van cryoprotectanten ernstig beperkt door de wasachtige lagen van Drosophila-embryo's, wat het ernstigste probleem is bij cryopreservatie van embryo's. Eerdere studies hebben inderdaad grote inspanningen geleverd om een tijdvenster te vinden waarin embryo's een hoog overlevingspercentage en een dunnere waslaag hebben. De tweede houdt zich bezig met ontwikkelings- en morfologische variatie tussen stammen. PGC's worden verzameld van embryo's in een vroeg stadium van 5 (2 uur 30 min-3 uur 20 minuten na het leggen van eieren), terwijl cryopreservatie van embryo's wordt uitgevoerd op embryo's in stadium 16 (14-22 uur na het leggen van eieren). De embryo's zijn daarom veel ouder en vertonen een veel grotere stamvariatie in het optimale tijdvenster voor cryopreservatie in vergelijking met PGC-cryopreservatie. Inderdaad, de frequentie van gastheren die van donoren afkomstige nakomelingen produceerden, varieerde niet tussen vijf stammen die door Asaoka et al.13 werden bestudeerd, hoewel de gastheren niet agametisch waren. Bovendien hebben PGC's het potentieel om te worden gebruikt in genetische manipulatietoepassingen, zoals genoombewerking 14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We danken het KYOTO Drosophila Stock Center voor vliegenstammen. We danken ook mevrouw Wanda Miyata voor de Engelstalige redactie van het manuscript en Dr. Jeremy Allen van Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van een concept van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) van het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) aan T.T.-S.-K., subsidies (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) van AMED aan SK, een subsidie (JP20km0210172) van AMED aan T.T.-S.-K. en S.K., een Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JP19K06780) van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) aan T.T.-S.-K., en een Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP18H05552) van JSPS aan S.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al.
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P.
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , Second Edition, Springer, Berlin, Heidelberg. (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
