Ce protocole présente la différenciation des ostéoclastes humains à partir des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et décrit des méthodes de caractérisation des ostéoclastes et des précurseurs d’ostéoclastes.
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Article de méthode
Différenciation et caractérisation des ostéoclastes à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole détaille la propagation et le passage des cellules iPS humaines et leur différenciation en ostéoclastes. Tout d’abord, les cellules iPS sont dissociées en une suspension unicellulaire pour une utilisation ultérieure dans l’induction du corps embryoïde. Après induction mésodermique, les corps embryoïdes subissent une différenciation hématopoïétique, produisant une population de cellules hématopoïétiques flottantes. Par la suite, les cellules hématopoïétiques récoltées subissent une étape de maturation du facteur de stimulation des colonies de macrophages et, enfin, une différenciation des ostéoclastes. Après différenciation des ostéoclastes, les ostéoclastes sont caractérisés par une coloration pour TRAP en conjonction avec une coloration nucléaire au vert de méthyle. Les ostéoclastes sont observés sous forme de polycaryons multinucléés TRAP+. Leur identification peut être renforcée par la coloration à la cathepsine K. Les tests de résorption osseuse et minérale permettent une caractérisation fonctionnelle, confirmant l’identité d’ostéoclastes authentiques. Ce protocole démontre une méthode robuste et polyvalente pour différencier les ostéoclastes humains des cellules iPS et permet une adoption facile dans les applications nécessitant de grandes quantités d’ostéoclastes humains fonctionnels. Des applications dans les domaines de la recherche sur les os, du cancer, de l’ingénierie tissulaire et de la recherche sur les endoprothèses pourraient être envisagées.
Introduction
Les ostéoclastes (OC) sont des types cellulaires polyvalents dérivés de l’hématopoïétique 1,2 qui sont couramment utilisés par les chercheurs dans des domaines tels que la recherche sur les maladies osseuses 3,4, la recherche sur le cancer 5,6, l’ingénierie tissulaire 7,8 et la recherche sur les endoprothèses 9,10. Néanmoins, la différenciation des CO peut être difficile car la ....
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Protocole
REMARQUE : Tous les réactifs utilisés dans ce protocole se trouvent dans la table des matériaux. Sauf indication contraire, tous les milieux ont été pré-équilibrés à 37 °C avant utilisation. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 37 °C et en utilisant le mode d’accélération/décélération le plus lent. Sauf indication contraire, le surnageant est toujours éliminé à l’aide de pipettes jetables en verre Pasteur.
1. Décongélation et propagation des cellules iPS humaines
- Un jour avant la décongélation des CSPi, enduire un puits d’une plaque à 6 puits de 1 mL d’un extrait de membrane basal....
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Résultats
Suivi de la morphologie cellulaire tout au long du processus de différenciation
Tous les résultats décrits ci-dessous ont été générés à l’aide de la lignée MCND-TENS2 iPSC pour la différenciation OC. Cette lignée iPSC a déjà été utilisée dans plusieurs études 32,33. Néanmoins, d’autres lignées iPSC ont également été utilisées avec succès avec ce protocole de différenciation.
L’évaluation visuelle régulière révèle de.......
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Discussion
Ce protocole offre une méthode fiable et robuste pour différencier les cellules iPS en CO. Néanmoins, il existe plusieurs pièges qui peuvent être rencontrés tout au long du processus de différenciation. Des lignées de CSPi humaines générées à partir de cellules d’origines tissulaires différentes ont été différenciées avec succès à l’aide de ce protocole33. Lors de la congélation des cellules iPS (voir l’étape de protocole « 3. Congélation des cellules iPS »), un puits au point de passage a été rec.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Giachelli pour leur aide technique et leur soutien. Nous remercions le Centre de microscopie W. M. Keck et le directeur du Centre Keck, le Dr Nathanial Peters, pour leur aide dans l’obtention des images de microscopie confocale et de microscopie à grand champ. Nous remercions également l’UW Flow Core Facility et le directeur de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, pour leur soutien technique et leur assistance. Enfin, nous remercions Hannah Blümke pour son soutien en matière d’illustration et de conception graphique.
Le financement a été fourni par le biai....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anticorps 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| - Anti-Cathepsine K ; | Anticorps | Abcam ab19027 | |
| - Anticorps anti-humain CD45 | BD | 555485 | |
| - IgG1 de souris conjugué à l’APC, &kappa ; Contrôle des isotypes | BD | 555751 | |
| Anticorps - Anticorps anti-humains CD14 | 563372 | ||
| BV711 - IgG2b de souris conjugués à la BV711, &kappa ; Contrôle d’isotype | BD | 563125 | |
| Anticorps - Chèvre Anti-Lapin IgG H& L Alexa Fluor® ; 647 | Abcam | ab150079 | |
| Anticorps anti-CD14 humain conjugué au PE | R& D Systems | FAB3832P-025 | |
| Anticorps - Intégrine humaine alpha M/CD11b conjuguée au PE | & D Systems | FAB16991P-025 | |
| Anticorps anti-humain conjugué au PE-Cy7 CD34 | BD | 560710 | |
| Anticorps - IgG1 de souris conjugué au PE-Cy7 &kappa ; Contrôle des isotypes | BD | 557872 | |
| Anticorps anti-CD11b humain conjugué PE/Cyanine5 | Biolegend | 301308 | |
| Anticorps - IgG1 de souris conjugué à PE/Cyanine5, &kappa ; Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Anticorps - Souris conjuguée PerCP-Cy5.5 IgG1 &kappa ; Contrôle d’isotype | BD | 550795 | |
| Anticorps - PerCpCy5.5-conjugué Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Kit de dosage de résorption osseuse | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Compteur de cellules automatisé ThermoFisher | 16812556 | ||
| Cultrex Qualifié de cellules souches Facteur de croissance réduit Extrait de membrane basale | R& D Sytems | 3434-010-02 | Extrait de membrane basale |
| DAPI | R& D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 avec 15 mM | de cellules souches | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Protéine morphogénétique osseuse humaine 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| IL-3 humaine | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Facteur de stimulation des colonies de macrophages humains (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Activateur du récepteur soluble humain du facteur nucléaire-&kappa ; B Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Facteur de cellules souches humaines (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (solution de blocage du récepteur Fc) | Biolegend | 422301 | |
| Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM &alpha ;, nucléosides, sans rouge de phénol | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Milieu de cryoconservation sans sérum |
| mTeSR Plus milieu | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Milieu sans sérum iPSC humain (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U Bottom-Saw Microplaque | Thermo Scientific | 174925 | Fond rond fixation ultra-basse Plaque à 96 puits |
| P1000 Embouts à alésage large | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Milieu de culture cellulaire hématopoïétique |
| TrypLE Select Enzyme (1X), sans rouge de phénol | Thermo Fisher | 12563011 | Réactif de dissociation unicellulaire |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum | Bioscience Lonza | 04-418Q | Milieu basal hématopoïétique |
| µ ;-Slide 8 Bien élevé | Ibidi | 80806 |
Références
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and ....
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Réimpressions et autorisations
