Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Nükleozomlar, ökaryotik kromatinin birincil birimini oluşturur ve biyofiziksel özellikleri ve kromatin bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri hakkında çok sayıda bilgilendirici tek moleküllü araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu çalışmalar için DNA üzerinde nükleozom sulandırması tipik olarak, bir DNA bağı boyunca oluşan nükleozomların yerleşimi ve sayısı üzerinde hassas kontrol sağlayan bir tuz diyaliz prosedürünü içerir. Bununla birlikte, bu protokol zaman alıcıdır ve girdi olarak önemli miktarda DNA ve histon oktameri gerektirir. Alternatif bir strateji sunmak için, histon şaperon Nap1'i kullanan tek moleküllü kuvvet ve floresan mikroskobu için yerinde bir nükleozom sulandırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, kullanıcıların güçlü nükleozom konumlandırma dizilerine ihtiyaç duymadan herhangi bir DNA şablonunda nükleozomları birleştirmesine, talep üzerine nükleozom yoğunluğunu ayarlamasına ve daha az reaktif kullanmasına olanak tanır. Yerinde nükleozom oluşumu saniyeler içinde gerçekleşir ve daha basit bir deneysel iş akışı ve tek moleküllü ölçümlere uygun bir geçiş sunar. Nükleozom mekaniğini araştırmak ve tek tek proteinlerin kromatin üzerindeki davranışını görselleştirmek için iki aşağı akış testinin örnekleri daha fazla açıklanmaktadır.
Giriş
Ökaryotik kromatinin birincil paketleme birimi, ~147 baz çiftinin (bps) DNA'nın bir oktameri çekirdek histon proteinleri 1,2 etrafına sarıldığı nükleozomdur. Genom paketlemeye ek olarak, nükleozom mimarisi, çeşitli işlevlerini yerine getirirken kromatin bağlayıcı proteinler tarafından kullanılabilecek başka bir zengin biyofiziksel düzenleme katmanı olarak hizmet eder 3,4. Nükleozomların fiziksel özelliklerine deneysel olarak erişmek ve bunları ölçmek teknik olarak zor olmuştur, çünkü bu birimler küçük ölçeklerde (örneğ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Biyotinile DNA'nın hazırlanması
- 20 μg λ DNA, 33 μM biotin-dCTP, 33 μM biotin-dUTP, 33 μM biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 ünite Klenow enzimi ve 1x NEB Tampon 2 içeren 120 μL'lik bir hacim reaksiyonu hazırlayın.
NOT: Bu prosedür özellikle 12-nükleotid (nt) 5' tek sarmallı (ss) DNA çıkıntısı23 içeren doğrusal çift sarmallı (ds) metilasyon içermeyen bakteriyofaj λ genomik DNA'yı (48,502 bps) kullanır. Bununla birlikte, protokol, en az birkaç nts ss....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Adım 3'te (Şekil 1A) açıklanan kurulum kullanılarak, DNA bağı boyunca nükleozom oluşumu, bir 2D taramada kırmızı floresan odakların görünümü (Şekil 1B, solda) veya bir kimografide zaman içinde yörüngeler (Şekil 1B, sağ) olarak görselleştirildi. Düzgün bir şekilde sarılmış nükleozomlar, konfokal tespitin kırınım sınırı (~ 300 nm) içinde zaman içinde sabit olan floresan yörüngeleri verdi. Özellikle, kırınım sınırı altında birbirine ya.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Açıklanan protokol, nükleozomun yeniden yapılandırılması için, reaktifleri ve zamanı en aza indirmenin yanı sıra herhangi bir (potansiyel olarak doğal) DNA dizisi boyunca şaperona bağımlı nükleozom oluşumunu mümkün kılmak da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar. Ayrıca, yerinde yöntem, daha basit deneysel iş akışına ve nükleozom mekaniği ve protein-kromatin etkileşiminin tek moleküllü tahlillerine uygun bir geçişe izin verir. Öte yandan, bu yaklaşımın sınırlamaları, DNA b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.
Teşekkürler
G. N. L. C., Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü'nden F31MH132306 numaralı ödülle destek aldığını kabul eder. SL, Robertson Vakfı, Uluslararası Rett Sendromu Vakfı ve NIH (ödül numarası R01GM149862) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1x HR tamponu | N/A | N/A | 30 mM tris asetat pH 7.5, 20 mM magnezyum asetat, 50 mM potasyum klorür, 0.1 mg/mL BSA |
| 1x PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su) | N / A | N / A | 137 mM sodyum klorür, 2.7 mM potasyum klorür, 10 mM sodyum fosfat dibazik, 1.8 mM potasyum fosfat monobazik |
| Asetik asit, buzul | Millipore Sigma | AX0074-6 | Tris asetat yapmak için kullanın |
| Biotin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-BIOX-S | |
| Biotin-14-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO14-S | |
| Biotin-14-dCTP | Jena Bioscience | NU-956-BIO14-S | |
| Sığır Serumu Albümin | Millipore Sigma | A9418-50G | Çözün H2O'da ve 0.22 um filtreden geçer |
| Cy3 Maleimide Mono-Reaktif | Boya Cytiva | PA23031 | Maleimid işlevselleştirilmiş Cy3 florofor |
| dGTP | New England Biolabs | N0442S | |
| Eppendorf Santrifüj 5425 R | Fisher Scientific | 05-414-051 | tezgah üstü santrifüj |
| , Saf | Millipore Sigma | 459844 | |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Millipore Sigma | E9884 | H2O'da 0,5 M'ye |
| İnsan histon oktameri (H4, L50C; H2A, K119C) | N/A | N/A | Rekombinant histon proteinleri ve etiketleme mutasyonlarını barındıranlar, daha önce tarif edildiği gibi kurum içinde saflaştırıldı (bkz. ref. 33, 34, 35, 36). Kısaca rekombinant histonlar BL21 (De3) pLySS hücrelerinde (Promega) eksprese edildi. İnklüzyon cisimleri sonikasyondan sonra izole edildi ve histonlar denatüre edici koşullar altında ekstrakte edildi. Histonlar tampon A'ya (7 M üre, 10 mM tris hidroklorür pH 8.0, 100 mM sodyum klorür, 1 mM EDTA ve 5 mM 2-merkaptoetanol) diyalize edildi ve çözelti, Q Sefaroz Hızlı Akış (Cytiva) ile yüklü bir yerçekimi kolonuna eklendi. Akış daha sonra yerçekimi kolonu yüklü bir SP Sefaroz Hızlı Akış'a (Cytiva) eklendi ve histonlar, 600 mM sodyum klorür ile takviye edilmiş tampon A eklenerek kolondan ayrıştırıldı. Etiketleme mutasyonlarını barındıran histonlar (H4, L50C; H2A, K119C) saflaştırıldı ve daha sonra 20: 1 boya-protein molar oranı kullanılarak maleimid ile işlevselleştirilmiş boyalar (Cytiva, Lumidyne) yoluyla istenen florofora konjuge edildi (bkz. ref. 33, 34). Histon oktamerleri, denatüre edici koşullar altında her bir vahşi tip veya florofor etiketli histonun eşit bir molar oranı eklenerek birleştirildi, 2 M sodyum klorür içeren yüksek tuzlu bir tampona diyaliz edildi ve daha sonra daha önce tarif edildiği gibi boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırıldı (bkz. ref. 36, 37). Alternatif olarak, bireysel histon proteinleri ve hazır histon oktamerleri ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Epicypher). |
| Görüntü arabelleği | N/A | N/ | A 20 mM tris hidroklorür pH 8.0, 100 mM sodyum klorür |
| Klenow Parçası (3' ila 5' ekzo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| Lambda DNA (dam-, dcm-) | Thermo Fisher Scientific | SD0021 | Metilasyon içermeyen ve lambda; DNA |
| LD655-MAL | Lumidyne Teknolojileri | 9 | Maleimid işlevselleştirilmiş LD655 florofor |
| Bağlayıcı histon H1.4 (A4C) | N/A | N/A | Şirket içinde yapılan saflaştırılmış rekombinant protein (bkz. ref. 38) |
| LUMICKS C-Trap Dymo | LUMICKS | N/A | Çift tuzak konfigürasyonu; üretici tarafından sağlanan cihaz için standart malzemeler |
| Magnezyum asetat çözeltisi | Kırlangıç Sigma | 63052-100ML | HR tamponu yapmak için kullanın |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Klenow Fragment kit ile birlikte verilir |
| Pluronic F-127 | Millipore Sigma | P2443-250G | H2O'da çözün ve 0.22 um filtreden geçirin |
| Potasyum klorür | Millipore Sigma | P3911 | PBS ve HR tamponu yapmak için kullanın |
| Potasyum fosfat monobazik | Millipore Sigma | P0662 | PBS |
| S. cerevisiae yapmak için kullanın> | Nap1 N/A | N/A | Nap1, daha önce açıklandığı gibi şirket içinde saflaştırılmıştır (bkz. ref. 33, 34). Alternatif olarak, Nap1 ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Active Motif). |
| Sodyum asetat | Millipore Sigma | 241245 | H2O'da 3 M'ye Çözün |
| Sodyum klorür | Millipore Sigma | S9888 | PBS ve görüntü tamponu yapmak için kullanın |
| Sodyum fosfat dibazik | Millipore Sigma | S9763 | |
| PBS SPHERO Biotin Kaplı Parçacıklar (3.0-3.4 ve mikro; m) | Spherotech | TP-30-5 | |
| Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometre | Fisher Scientific | ND2000 | NanoDrop Spektrofotometre |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | H2O'da çözün ve uygun pH'a ayarlayın; Görüntü arabelleği ve tris asetat yapmak için kullanın |
Kaynaklar
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
