Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi
Bu makalede
Özet
Özet
Adaptif bağışıklık tepkisi, bir T hücresinin patojenlere ve yabancı cisimlere yanıt olarak kan, lenf ve doku yoluyla göç etme yeteneğine bağlıdır. T hücresi göçü, kemokinler, kemokin reseptörleri ve adezyon molekülleri dahil olmak üzere çevreden ve yerel bağışıklık hücrelerinden gelen birçok sinyal girişinin koordinasyonunu gerektiren karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, T hücresi motilitesi, aktivasyon durumunu, transkripsiyonel manzarayı, adezyon molekülü ekspresyonunu ve daha fazlasını değiştirebilen dinamik çevreleyen çevresel ipuçlarından etkilenir. İn vivo, görünüşte iç içe geçmiş bu faktörlerin karmaşıklığı, T hücresi göçüne katkıda bulunan bireysel sinyalleri ayırt etmeyi zorlaştırır. Bu protokol, son derece spesifik çevresel koşullar altında T hücresi göçünü gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için T hücresi izolasyonundan bilgisayar destekli analize kadar bir dizi yöntem sağlar. Bu koşullar, göçü düzenleyen mekanizmaları aydınlatmaya, T hücresi kinetiği anlayışımızı geliştirmeye ve hayvan deneyleri yoluyla elde edilmesi zor olan güçlü mekanik kanıtlar sağlamaya yardımcı olabilir. Hücre göçünü etkileyen moleküler etkileşimlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, gelişmiş terapötikler geliştirmek için önemlidir.
Giriş
T hücreleri, adaptif, antijene özgü immün yanıtın ana efektörleridir. Popülasyon düzeyinde, T hücreleri heterojendir ve farklı özel işlevlere sahip hücresel alt kümelerden oluşur. Daha da önemlisi, CD8 + T hücreleri, enfekte olmuş veya işlevsiz hücreleri doğrudan ortadan kaldıran bağışıklık sisteminin ana sitolitik efektörleridir1.
Olgun CD8 + T hücreleri dokuda bulunur ve antijen aramak için kan ve lenfatiklerde dolaşır. Enfeksiyon sırasında, T hücreleri kan veya dokuda antijenlerle sunulur ve üretken bir bağışıklık tepkisi başlatmak için hızla dalağa veya en yakın drenaj lenf noduna boşalır. Her iki durumda da, T h....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan protokolleri, Rochester Üniversitesi'ndeki Üniversite Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmadaki fareler, Rochester Üniversitesi hayvan tesisinin patojen içermeyen alanında tutuldu. Bu çalışma için 6-12 haftalık (15-30 g) erkek / dişi C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Fare dokusu izolasyonu, elleri örtmek için eldivenler ve burun ve ağzı kapatmak için bir yüz maskesi ile bir tezgah üzerinde veya bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilebilir. Tüm hücre kültürü ve plaka hazırlığı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
T hücresi aktivasyonunun doğrulanması, murin T hücrelerinde6 kanonik aktivasyon belirteçleri olan CD69 ve CD44'ün artmış ekspresyonunu arayan akış sitometrisi ile sağlanabilir. Ek olarak, T hücresi popülasyonunun saflığı, CD3 + CD8 + T hücreleri için akış sitometrisi ile belirlenebilir. Bu yöntem %>90 CD8+ T hücre popülasyonu sağlar.
T hücresi göçü, hem tekrarlanabilir hem de araştırmacının ihtiyaçlarına uyacak şekilde ayarlanabilen y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İn vivo olarak yakınsak sinyallerin biyolojik etkisini anlamak zordur ve yorumlanması kolay değildir. Burada sunulan protokoller, yüksek düzeyde tanımlanmış ve biyolojik olarak ilgili koşullarda T hücresi göçünü anlamak için makul bir yöntem sağlar. Bu koşullar, araştırmacının takdirine bağlı olarak belirlenebilir ve protokoller, çeşitli T hücresi popülasyonlarının, aktivasyon durumunun ve hücre fenotipinin ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, birçok ligand ve reseptör, bu tanımlanmış antikor b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, tüm araştırma ve makale hazırlığının, potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.
Teşekkürler
Zaman içinde bu protokollerin geliştirilmesine katkıda bulunan Kim Lab'ın önceki ve mevcut üyelerine teşekkür ederiz. Temsili veriler P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri ve P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri tarafından mümkün kılınmıştır. Bu yayın, kısmen Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü'nden GM135134 T32 Hibe Numarası ile mümkün olmuştur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 cm'lik çanak | Corning | 353003 | veya eşdeğeri |
| 15 mL konik tüp | ThermoFisher | 339650 | veya eşdeğeri |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | kalsiyum ve magnezyum içermez |
| 6 oyuklu plaka, TC işlem görmemiş | Corning | 3736 | veya eşdeğeri |
| 70 &mikro; m hücreli süzgeç | FisherScientific | 352350 | veya eşdeğeri |
| ACK parçalama tamponu | ThermoFisher | A1049201 | veya eşdeğeri |
| Allegra 6KR santrifüj | ThermoScientific | sorvall 16R, tx400 3655 rotor ve kova | veya eşdeğeri |
| Beta merkaptoetanol | Sigma | M3148 | veya eşdeğeri |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Veya eşdeğeri |
| Santrifüj | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | veya eşdeğeri |
| Kollajen (IV) | Corning | 354233 | veya eşdeğeri |
| DeltaT kültür kabı .17 mm kalınlığında cam şeffaf | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Koyun sıçan önleyici IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Mıknatıslı | ThermoFisher Scientific | 12301D | veya eşdeğeri |
| Kolay sep fare T hücre izolasyon kiti | Kök Hücre | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | veya eşdeğeri |
| Fibronektin | SigmaAldrich | 10838039001 | veya eşdeğeri |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filtre küpleri | Nikon veya Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | veya eşdeğeri |
| HQ CCD kamera | CoolSNAP | veya eşdeğeri | |
| https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | takın web bağlantısı | ||
| L-15 | Çeşitli Bkz | . Malzemeler | Orta Tarif: Leibovitz' 1-5 g/L glikoz ile desteklenmiş fenol kırmızısı (Gibco) içermeyen L-15 ortamı |
| Liebovitz'in L-15 ortamı, fenol kırmızısı içermez | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok tek kullanımlık şırınga | Fisher Scientific | 14-955-459 | veya eşdeğeri |
| Lenfosit ayırma ortamı | Corning | 25-072-CI | veya eşdeğeri |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler | ThermoFisher | 11140050 | veya eşdeğeri |
| Mikroskop ısıtma sistemi | Okolab | okolab.com | Özel tasarımlar mevcuttur |
| Millicell EZ slayt | Millipore | C86024 | |
| Mojosort fare CD8 + Naï ve T hücre izolasyon kiti | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R& D sistemleri | 8875-EC-050 | veya eşdeğeri |
| Fare cerrahi diseksiyon kiti | Fisher Scientific | 13-820-096 | veya eşdeğeri |
| NIS öğeleri | Nikon | Yazılımı | |
| TC olmayan 24wp | Corning | 353047 | veya eşdeğeri |
| Penisilin-streptomisin | ThermoFisher | 15140122 | veya eşdeğeri |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | veya eşdeğeri | |
| R9 | Çeşitli Bakınız | Malzemeleri | Orta Tarif: RPMI 1640x, %10 FBS, %1 antibiyotik-antimikotik (Gibco), 20 mM HEPES tamponu (Gibco), %1 MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (Gibco), 50 & mu; M β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich) |
| Rekombinant fare ICAM-1 Fc chimera | R& D sistemleri | 796-IC-050 | veya eşdeğeri |
| Rekombinant Fare IL2 | Biolegend | 575410 | veya eşdeğeri |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | veya eşdeğeri |
| T pinleri | Fisher | Scientific S99385 | veya eşdeğeri |
| TE2000-U mikroskobu | Nikon | veya eşdeğeri | |
| Çeşitli rekombinant fare kemokini | R& D sistemleri | veya eşdeğeri | |
| VCAM-1 Fc chimera | R& D sistemleri | 643-VM-050 | veya eşdeğeri |
| Volocity | PerkinElmer | Yazılımı |
Kaynaklar
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
