本文建立了一种用于制备受精后小鼠胚胎单细胞和细胞核高质量悬液的流程，以进行单细胞和单细胞核测序。
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本文内容
摘要
摘要
近十年来，单细胞技术已成为研究基因表达动态、细胞异质性以及样本内细胞状态的金标准。在单细胞技术发展之前，捕获早期发育过程中动态的细胞图谱和快速的细胞转变是极为有限的。本文设计了一种稳健的流程，用于对从胚胎第6.5天（E6.5）到第8天（E8）的小鼠胚胎进行单细胞和细胞核分析，这一时期对应于原肠胚形成（gastrulation）的起始和完成阶段。原肠胚形成是发育过程中的一个基本事件，其建立了三个胚层：中胚层、外胚层和内胚层，这些胚层对器官发生至关重要。目前已有大量文献报道了将单细胞组学技术应用于野生型原肠胚期胚胎的研究。然而，对突变型胚胎的单细胞分析仍较为稀少，且通常局限于通过流式细胞分选（FACS）获得的细胞群体。这在一定程度上是由于技术限制所致，包括基因分型的需求、定时交配、每窝妊娠中具有目标基因型的胚胎数量，以及此阶段每个胚胎所含细胞数目的限制。本文提出了一种旨在克服上述限制的方法。该方法建立了繁殖和定时妊娠的操作规范，以提高获得同步妊娠且具有目标基因型胚胎的概率。通过优化胚胎分离流程，并结合当天完成的基因分型方案（3小时），可在同一天内完成基于微滴的单细胞分析，从而确保细胞的高存活率和可靠的结果。该方法还包含了从胚胎中高效分离细胞核的操作指南。因此，这些策略提高了在原肠胚阶段对突变型胚胎进行单细胞分析的可行性。我们预期该方法将有助于解析突变如何塑造原肠胚的细胞图谱。
引言
原肠胚形成是正常发育所必需的基本过程。这一快速而动态的过程发生在多能性细胞转变为决定器官如何形成的谱系特异性前体细胞时。多年来，原肠胚形成一直被定义为形成三个基本均一的细胞群体：中胚层、外胚层和内胚层。然而，高分辨率技术以及越来越多的胚胎干细胞模型1,2揭示了早期胚层之间存在前所未有的异质性3,4。这表明，关于原肠胚中不同细胞群体的调控机制，仍有大量未知有待揭示。小鼠胚胎发育是研究原肠胚形成期间早期细胞命运决定的最佳模型之一3,5。小鼠的原肠胚形成过程非常迅速，整个过程在48小时内完成，从胚胎发育第6.5天（E6.5）持续至第8天（E8）5。
单细胞技术的最新进展使得对野生型小鼠胚胎发育进行精细图谱绘制成为可能，从而全面概述了原肠胚形成期间胚胎的细胞和分子景观3,4,6,
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方案
本方案及所述所有动物实验均已正式获得天普大学机构动物照护与使用委员会的批准，并符合该委员会根据国际实验动物评估与认证协会指南所制定的机构规定。所述所有小鼠均采用 C57/BL6N 背景品系。在这些研究中未观察到任何动物健康问题。
1. 繁殖群体与定时交配
- 通过观察阴道栓来确定妊娠时间。发现阴道栓当天的中午定为 E0.5。
- 将小鼠饲养在含有碎硬木屑垫料和纸质筑巢材料的笼子中。
- 每个笼子应提供小鼠饲料、新鲜饮水和一种环境丰富化物品（例如隧道和筑巢材料）。在定时交配期间，每天记录并收集种群信息。
- 记录所有相关信息，例如小鼠年龄、雌性小鼠既往妊娠次数、雄性小鼠造成阴道栓的次数，以及雌性小鼠的动情周期阶段（图2）。
注意：已经生产过1-2次的雌性小鼠在后续妊娠中通常会产下更多的仔鼠。
- 在开始定时交配前，将雄性小鼠单独饲养于笼中，持续至少1周。在开始交配的一周内，将至少1只雌性小鼠与雄性小鼠共同放入同一笼中。
注意：根据批准的动物实验方案，允许且更推荐在交配笼中加入2-3只雌性小鼠，以提高阴道栓的形成率。 - 设置至少4组交配组合（每1只雄性配2只雌性），以增加不同笼子间同步妊娠的可能性（即同一天出现多个阴道栓），....
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结果
本文设计的方法专门用于改进从E6.5至E8阶段胚胎样本的单细胞组学制备。该稳健的流程包括五个主要步骤：同步化定时交配、胚胎分离、同日基因分型、细胞解离以及细胞活力评估（图1A）。尽管本文数据主要聚焦于E7至E7.5时间点，但该方法也可应用于至E8的胚胎（图1B），仅需对操作步骤进行微小调整（参见实验方案中的相关注释）。同步化定时交配通过将两只雌性小鼠与一只雄性小鼠共同饲养实现。每天早晨10点前检查阴道栓，若观察到明显栓块，则当天中午记为E0.5（图2A）。在本研究中，获得理想阴道栓的条件为：将处于动情期或动情前期的雌性小鼠与既往繁殖中能成功产生多个栓块的雄性小鼠配对（图2B）。仅将明显可见的栓块用于后续胚胎分离（图2C）。
发育时间根据时间表进行估算
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讨论
本文介绍了一种用于从小鼠原肠胚中获取高质量单细胞和细胞核悬液的稳健流程，该流程专门设计用于促进对早期发育过程中细胞命运决定机制的研究。该方法通过优化需要基因型分析（如性别或体细胞基因）的胚胎分析，填补了原肠胚形成研究领域的一个关键空白。通过利用基因突变小鼠模型并对完整小鼠胚胎进行高分辨率单细胞测序，该流程可进一步加深对小鼠早期原肠胚基因表达谱的理解。本方法通过Cre重组酶系统展示了使用基因突变小鼠模型在早期发育时间点获得高质量细胞和细胞核用于单细胞组学研究的可行性。该方法经历了多次尝试后逐步完善，在此前的实验中，样本未能达到文库构建和测序所需的质量标准。本方法通过优化三个关键步骤，能够从E8之前的小鼠胚胎中获得足够数量的细胞/细胞核：（1）同步化定时交配以增加胚胎数量；（2）当天完成基因分型以避免冻融过程；（3）评估细胞/细胞核的活力，以避免对濒死细胞进行测序。该方案已成功应用于单细胞RNA测序（scRNA-seq），但本方案所获得的细胞或细胞核悬液也可用于其他对细胞活力有要求的测序平台，例如smart-seq、drop-seq和cel-seq16。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢福克斯蔡斯癌症中心基因组学核心实验室以及Jonathan Whetstine博士实验室成员Zach Gray、Madison Honer和Benjamin Ferman为测序实验提供的技术支持。我们感谢Estáras博士实验室成员以及轮转研究生Alex Morris在单细胞研究的初步分析中所做出的贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R01HD106969和R56HL163146，授予Conchi Estaras。此外，Elizabeth Abraham获得了T32培训基金5T32HL091804-12的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL 超长移液屏障吸头 | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL 超长移液屏障吸头 | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL 超长移液屏障吸头 | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm 可逆滤网，小型 | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm 培养皿 | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8联管 PCR 管 | Genesee Scientific | 27-125U | |
| 琼脂糖 | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock 迷你干浴仪 | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle 制冷微量离心机 | Genesee | 33-759R | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium 控制器 | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 自动细胞计数仪 | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess 细胞计数板载玻片 | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 试剂 | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| 皂苷 | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR 卵黄囊试剂 | Viagen | 201-Y | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind 管 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM, 1x） | CORNING | 10-013-CV | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS） | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 乙醇 | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 成像系统 | Invitrogen | AMF7000 | |
| 精细剪刀 - 锐利型 | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp 热循环仪 | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 试剂（100 个循环）v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 体视显微镜 | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| 无核酸酶水 | GenClone | 25-511 | |
| 光学管条 8x（401428） | Agilent | 401428 | |
| 光学管盖条 8x（401425） | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511 HS24 微型离心机，配备 24 x 1.5/2.0 mL 转子，每台 1 台离心机 | Genesee | 31-511 | |
| 蛋白酶 K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA 定量检测试剂盒 | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase 抑制剂 | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| 标准齿镊 | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station 加样吸头 | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCl（pH 7） | Quality Biological | 351-007-101 | |
| 台盼蓝染液 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| IKA MS3 涡旋混合器，配备 96 孔板适配器 | IKA | 3617000 |
参考文献
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biolo....
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