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方法文章

小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/66945

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2024年7月26日

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的实验方案。

摘要

胸腺上皮细胞（TECs）在促进T细胞的发育和受体库选择中发挥着至关重要的作用。位于胸腺皮质的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）可诱导早期T细胞发育并对皮质胸腺细胞进行阳性选择。相比之下，位于胸腺髓质的髓质胸腺上皮细胞（mTECs）则吸引来自皮质的阳性选择胸腺细胞，并在T细胞中建立自身耐受。多种分子参与支持胸腺功能以促进T细胞的发育与选择，其中包括cTECs中表达的DLL4和beta5t，以及mTECs中表达的Aire和CCL21。尽管目前制备TECs单细胞悬液的方法仅能从年轻成年小鼠胸腺中回收少量TECs（cTECs约1%，mTECs约10%），但对cTECs和mTECs中功能相关分子进行流式细胞术分析仍有助于加深我们对TECs生物学特性的理解。由于TECs中许多功能相关分子定位于细胞内，本文描述了我们用于制备小鼠TECs单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以进行流式细胞术分析的实验方案。

引言

胸腺是一种上皮-间充质器官，可促进T淋巴细胞的发育及其受体库的选择。在胸腺的皮质和髓质微环境中，胸腺上皮细胞（TECs）在指导T细胞发育和选择过程中发挥关键作用。目前普遍认为，胸腺皮质中的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）主要参与诱导早期T细胞发育，并促进新生成的表达T细胞抗原受体（TCR）的胸腺细胞进行阳性选择。相比之下，胸腺髓质中的髓质胸腺上皮细胞（mTECs）对于吸引来自皮质的阳性选择胸腺细胞至关重要，并通过清除自身反应性T细胞以及生成调节性T细胞来建立中枢自身耐受1,2。TECs在支持T细胞发育和选择方面的这些功能，是通过cTECs和mTECs中表达的多种分子介导的。

这些分子包括Delta样配体4（DLL4），对淋巴样前体细胞的T细胞谱系特化至关重要3,4；beta5t（也称为Psmb11，对CD8 T细胞的阳性选择至关重要）5,6；以及Prss16（也称为胸腺特异性丝氨酸蛋白酶，或TSSP，对CD4 T细胞的阳性选择至关重要）7,8，这些分子在cTEC中表达；还包括自身免疫调节因子（Aire，对自身基因的异位表达至关重要）9,10、Fez家族锌指蛋白2（Fezf2，对Aire非依赖性自身基因的异位表达及胸腺tuft细胞的生成至关重要）11,12,13,14，以及C-C基序趋化因子配体21（CCL21，对阳性选择后胸腺细胞向髓质迁移和聚集至关重要）14,15,16，这些分子在mTEC中表达。流式细胞术可用于定量检测胸腺上皮细胞（TEC）中这些功能重要的分子，有助于评估cTEC和mTEC的发育与功能状态。由于TEC中的许多分子主要在细胞内表达，例如位于胞质（如蛋白酶体组分beta5t）或细胞核（如转录调控因子Aire）中，因此采用流式细胞术对cTEC和mTEC中的细胞内分子进行定量分析具有显著优势。

胸腺上皮细胞（TECs）在胸腺中数量稀少。一只5周龄的雌性小鼠约含有1 × 106个皮质胸腺上皮细胞（cTECs）和约2.5 × 106个髓质胸腺上皮细胞（mTECs），而胸腺皮质中含有约3 × 108个CD4+CD8+胸腺细胞，胸腺髓质中含有约5 × 107个CD4+CD8-和CD4-CD8+胸腺细胞17。因此，在年轻成年小鼠中，胸腺内绝大多数（>99%）的细胞为造血来源的细胞（包括胸腺细胞），而非TECs。此外，TECs在胸腺内与邻近细胞（如胸腺细胞）以及结构性的细胞外成分（如胶原蛋白）紧密结合，因此将TECs释放为单细胞悬液需要对胸腺进行蛋白酶消化。传统的酶消化方法仅能获得少量TECs；从5周龄小鼠胸腺中分别仅能获得约1%（1 × 104）的cTECs和约10%（2 × 105）的mTECs17,18,19。TECs从胸腺中释放效率低下的原因可能在于TECs对蛋白水解酶和机械应力较为敏感，以及TECs与邻近细胞（特别是cTECs与CD4+CD8+胸腺细胞之间）的紧密结合20。因此，目前基于酶消化法所获得的单细胞悬液进行的小鼠TECs单细胞分析（包括流式细胞术分析和单细胞RNA测序分析）仅代表了TECs中的一小部分，远未达到全面性。尽管如此，尽管酶法获取TECs存在上述局限性，对单细胞悬液中小鼠TECs进行流式细胞术分析仍可用于cTECs和mTECs中功能相关分子的定量分析。在单细胞悬液中，TECs被定义为上皮细胞表面分子EpCAM（CD326）阳性而造血细胞表面分子CD45阴性的细胞。在EpCAM+CD45- TECs群体中，细胞表面Ly51分子（又称BP-1或CD249）的表达水平以及荆豆凝集素I（UEA1）的结合能力（主要结合含α-连接岩藻糖的糖蛋白和糖脂）被用于表型区分cTECs（Ly51highUEA1low）和mTECs（Ly51lowUEA1high）。本文中，我们描述了常规制备小鼠TECs单细胞悬液的实验方案，以及针对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的方法，重点聚焦于对新制备的小鼠TECs中细胞内分子beta5t、CCL21和Aire的定量分析。

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方案

所有小鼠实验均在国家癌症研究所动物护理和使用委员会（ASP21-431、ASP21-432 和 EIB-076-3）的批准下进行。

1. 胸腺细胞悬液的制备

注意：小鼠的个体发育会影响从胸腺中酶解分离胸腺上皮细胞（TEC）的效率。以下根据小鼠年龄描述了三种方法。

  1. 适用于出生后超过3周的小鼠
    1. 从小鼠体内取出胸腺（两个胸腺叶），置于盛有5 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基的60 mm塑料培养皿中，冰上放置。
    2. 在解剖显微镜下，使用弯头精细镊子去除血液、非胸腺组织和脂肪。用解剖剪将胸腺剪成小块（大小约1-2 mm）。
    3. 将胸腺组织块转移至含有3 mL RPMI1640培养基的15 mL锥形管中，培养基中含1 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase，并含2%胎牛血清（FBS）。在37 °C水浴或加热块中孵育20分钟。
    4. 用3 mL塑料移液管轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育20分钟。
    5. 用3 mL塑料移液管轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育10分钟。
    6. 用3 mL塑料移液管轻轻混匀，加入5 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。
    7. 将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至新的50 mL锥形管中。在4 °C下以350 × g离心5分钟。
    8. 用10 mL FACS缓冲液（含1%牛血清白蛋白[BSA]和0.1% NaN3的1x HBSS）重悬细胞沉淀。
    9. 将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。
  2. 适用于出生后1至2周的小鼠
    1. 执行步骤1.1.1。
    2. 在解剖显微镜下，使用解剖镊去除血液和非胸腺组织。将胸腺转移至含有200 µL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基的1.5 mL塑料离心管中，并用解剖剪将胸腺剪成小块（大小约1-2 mm）。
    3. 让胸腺碎片沉降至管底，然后用200 µL移液器小心吸除上清液。
    4. 将胸腺组织块转移至含有2 mL RPMI1640培养基的5 mL聚丙烯圆底管中，培养基中含0.5 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase，并含2% FBS。在37 °C水浴或加热块中孵育10分钟。
    5. 用3 mL塑料移液管轻轻混匀，再使用带塑料吸头的1 mL移液器进一步均质化。
    6. 加入2 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至50 mL锥形管中。加入16 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基。
    7. 在4 °C下以350 × g离心5分钟。用10 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。
    8. 将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。
  3. 适用于胚胎期小鼠及出生后1周内的新生小鼠
    1. 从小鼠体内取出胸腺（两个胸腺叶），置于60 mm塑料培养皿中，在解剖显微镜下使用弯头精细镊子去除血液、非胸腺组织和脂肪。
    2. 将胸腺置于含10 mM HEPES的RPMI1640培养基0.2 mL中，放入1.5 mL微量离心管。用200 µL移液器弃去液体。
    3. 加入0.5 mL含2% FBS的RPMI1640培养基，其中含0.5 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase。在37 °C水浴或加热块中孵育10分钟。使用带塑料吸头的1 mL移液器轻轻混匀。
    4. 加入0.5 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至新的15 mL锥形管中。加入9 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基。
    5. 在4 °C下以350 × g离心5分钟。用1-3 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。
    6. 将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。
  4. 替代方法：Liberase消化法
    1. 执行步骤1.1.1和1.1.2。
    2. 让胸腺碎片沉降至管底，然后用200 µL移液器小心吸除上清液。将胸腺组织块转移至含有1 mL RPMI1640培养基的5 mL管中，培养基中含0.5 U/mL Liberase和1 U/mL DNase，并含10 mM HEPES。在37 °C水浴或加热块中孵育15分钟。
    3. 使用带塑料吸头的1 mL移液器轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育15分钟。
    4. 使用带塑料吸头的1 mL移液器轻轻混匀，加入1 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。
    5. 将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至新的50 mL锥形管中。加入18 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基。
    6. 在4 °C下以350 × g离心5分钟。用10 mL FACS缓冲液（含1% BSA和0.1% NaN3的1x HBSS）重悬细胞。
    7. 将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。

2. 胸腺细胞的抗体染色

  1. 将 16 × 106 个细胞置于 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  2. 在 FACS 缓冲液中加入 10 µL 工作浓度的抗 Fc 受体单克隆抗体（mAb，克隆号 2.4G2），以阻断染色用 IgG 与细胞表面 Fc 受体的非特异性结合。在 4 °C 下孵育 5 分钟。
  3. 在 FACS 缓冲液中分别加入 40 µL 工作浓度的抗 CD45 mAb（造血细胞特异性；例如 BV421 标记）、抗 EpCAM mAb（上皮细胞特异性；例如 PE-Cy7 标记）、抗 Ly51 mAb（cTEC 检测用；例如 AF647 标记）以及荆豆凝集素 I（UEA-1，mTEC 检测用；例如 AF594 标记）。同时，准备单色染色细胞和未染色细胞的对照管，用于流式细胞仪的设置。
  4. 在 4 °C 下孵育 45 分钟，每 10 分钟充分混匀一次。加入 2 mL FACS 缓冲液。
  5. 在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  6. 加入 1 µL Ghost Dye Violet 510（用于在固定和通透细胞的流式细胞分析中区分活细胞与死细胞）。使用未稀释的 Ghost Dye 试剂，充分混匀。在 4 °C 下孵育 30 分钟，每 10 分钟混匀一次。
  7. 加入 2 mL FACS 缓冲液。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  8. 加入 1 mL 含 2% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定细胞，并在室温下孵育 10 分钟。
  9. 向管中加入 3.5 mL PBS，在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。
  10. 加入 1 mL 细胞内固定/通透缓冲液，于 4 °C 下孵育 20 分钟，以通透细胞。
  11. 在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。
  12. 加入 1 mL 1× 通透缓冲液。在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。
  13. 在 1× 通透缓冲液中加入 100 µL 工作浓度的抗 beta5t 抗体或抗 CCL21 抗体，或 40 µL 工作浓度的抗 Aire 抗体（例如 AF488 标记），充分混匀后在室温下孵育 60 分钟。
  14. 加入 1 mL 1× 通透缓冲液。在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。
  15. 重复步骤 2.14。
  16. 加入 100 µL 工作浓度的抗兔 IgG 抗体（例如 AF555 标记），在室温下孵育 30 分钟。
  17. 加入 1 mL 1× 通透缓冲液。在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。
  18. 将细胞重悬于 200 µL FACS 缓冲液中，充分混匀。
  19. 将细胞避光保存于 4 °C，直至进行流式细胞分析。
  20. 在进行流式细胞分析前，通过 60 µm 尼龙滤网过滤细胞。

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结果

分析需要一台能够检测至少六个荧光通道（用于 CD45、EpCAM、Ly51、UEA1、Ghost Dye 以及 beta5t、CCL21 和/或 Aire）并具备前向散射和侧向散射参数的流式细胞仪。图中展示了 0 日龄小鼠和 2 周龄小鼠经胶原酶/分散酶消化后的胸腺细胞的代表性流式细胞术图谱 图1 和 图2，分别。在这两幅图中，面板中的点图 A 显示总颗粒信号的前向散射（FSC）强度和Ghost Dye Violet 510荧光强度。根据Ghost Dye试剂的阴性染色结果以及前向散射反映的细胞大小判断，超过90%的颗粒信号代表活细胞。图示 B 显示胸腺活细胞表面CD45和EpCAM的荧光信号，CD45为造血细胞表达的分子，EpCAM为上皮细胞表达的分子。其中存在一小群但特征明显的CD45阳性细胞- EpCAM+因此代表胸腺上皮细胞（TECs）。

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讨论

胶原酶（可联合或不联合中性蛋白酶Dispase）被广泛用于消化小鼠胸腺以制备胸腺上皮细胞（TECs）4,5,9,18,21。Liberase是一种包含胶原酶等多种蛋白酶的混合酶制剂，也常用于胸腺消化以制备TECs17,22。使用胶原酶与Liberase从小鼠胸腺中获得的皮质型胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质型胸腺上皮细胞（mTECs）在产量和质量上基本相当，尽管不同批次的酶产品可能导致细微差异。胰蛋白酶也可用于高效消化胸腺21,23，但已有研究表明，TECs表达的多种细胞表面分子（如...

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致谢

感谢大崎泉博士对文稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所和癌症研究中心的院内研究计划项目 ZIA BC 011806 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原酶/分散酶 Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装eBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 抗小鼠 CD45 单克隆抗体，克隆号 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly51 单克隆抗体，克隆号 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 抗小鼠 EpCAM/CD326 单克隆抗体，克隆号 G8.8BioLegend118216
DyLight 594 欧洲荆豆凝集素 I (UEA1)Vector LaboratoriesDL-1067-1
Alexa Fluor 488 抗小鼠 Aire 单克隆抗体，克隆号 5H12eBioscience53-5934-82
抗小鼠 Psmb11/beta5t 兔单克隆抗体，克隆号 CPTC-PSMB11(mouse)-1NIH NCICPTC-PSMB11(mouse)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
抗小鼠 CCL21/exodus 2 兔多克隆抗体Bio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 抗兔 IgG 重链山羊重组抗体InvitrogenA27039
抗小鼠 CD32/CD16 – 纯化型（Fc 阻断抗体）Leinco TechnologiesC247
60 微米尼龙筛网Component SupplyW31436
设备
ThermomixerEppendorf加热模块
Cellometer Auto 2000 细胞活力计数仪Nexcelom活细胞计数
LSRFortessa 细胞分析仪BD Biosciences流式细胞仪五激光系统（355、408、488、595 和 637 nm）
FACSDiva 软件 9.0.1 版本BD Biosciences流式细胞分析
FlowJo 10.9.0BD Biosciences流式细胞数据处理
抗体稀释比例（工作浓度）稀释缓冲液
抗小鼠 CD32/CD16 – 纯化型（Fc 阻断抗体）1:40FACS 缓冲液
BV421 抗小鼠 CD45 单克隆抗体1:25FACS 缓冲液
PE/Cy7 抗小鼠 EpCAM/CD326 单克隆抗体1:100FACS 缓冲液
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly51 单克隆抗体1:100FACS 缓冲液
DyLight 594 欧洲荆豆凝集素 I (UEA1)1:400FACS 缓冲液
抗小鼠 CCL21/exodus 2 兔多克隆抗体1:2001x 通透缓冲液
抗小鼠 Psmb11/beta5t 兔单克隆抗体，克隆号 CPTC-PSMB11(mouse)-11:10001x 通透缓冲液
Alexa Fluor 555 抗兔 IgG 重链山羊重组抗体1:4001x 通透缓冲液
缓冲液用途
含 10 mM HEPES 的 RPMI1640 用于细胞制备
含 2% FBS 的 RPMI1640用于细胞制备
FACS 缓冲液（含 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 1x HBSS）用于细胞制备和抗体染色
含 1 mg/ml 胶原酶/分散酶和 1 U/ml DNase 的 RPMI1640（含 2% FBS）用于酶消化
含 2% PFA 的 PBS用于细胞固定
固定/通透缓冲液（1 份固定/通透浓缩液与 3 份固定/通透稀释液混合）用于细胞固定
1x 通透缓冲液（1 份 10X 浓缩液与 9 份蒸馏水混合）用于胞内抗体染色 

参考文献

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