여기에서는 고출력 375nm 및 405nm 레이저가 Hoechst 33342를 효과적으로 여기시키고 측면 개체군(SP) 세포 검출을 위한 355nm 레이저의 실행 가능한 대안으로 작용하여 유세포 분석 응용 분야에서 사용 가능한 레이저의 범위를 확장할 수 있음을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
측면 집단(SP) 세포는 Hoechst 33342 염색을 통해 식별하고 유세포 분석(FCM)을 사용하여 분석합니다. Hoechst SP 방법은 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체의 염료 유출 특성을 기반으로 줄기 세포의 분리에 사용됩니다. 이 방법은 처음에는 조혈모세포(HSC)의 식별 및 분리에 사용되었지만, 현재는 주로 암 줄기세포(CSC)의 식별 및 분리에 초점을 맞추도록 발전했습니다. FCM의 기존 검출 방법은 355nm 레이저를 사용하여 염료를 여기시켜 SP 세포를 검출합니다. 이 연구를 통해 355nm 레이저를 사용한 SP 세포 검출을 효과적으로 대체할 수 있는 염료 여기(dye excitation)에 대한 대체 접근법을 성공적으로 식별했습니다. 이는 고출력 375nm 또는 405nm 레이저의 활용을 통해 달성됩니다. 이를 통해 355nm 레이저 유세포 분석에만 국한되지 않고 SP 세포 검출에서 향상된 선택성을 발휘할 수 있습니다.
서론
측면 집단(SP) 세포는 Hoechst 33342 염색을 통해 식별하고 유세포 분석(FCM)을 사용하여 분석합니다. SP 세포는 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체 1,2를 통해 세포 밖으로 형광 DNA 염료를 펌핑하는 것이 특징입니다. 이 방법은 원래 쥐 골수 조혈모세포(HSC)를 분리하기 위해 확립되었습니다1. 골수 SP 세포는 CD117+Sca-1+Lin-Thy1 저발현 3,4를 특징으로 하는 HSC 집단으로 농축되었습니다. 그 후, 이 방법은 심장 근육5, 간6, 폐7, 신장8 및 전뇌9를 포함한 다른 조직으로부터 줄기 세포를 분리하고 농축하는 데 널리 사용되었습니다. 특히 이 방법은 지난 10년 동안 암 줄기세포(CSC)를 분리하는 데 적용되었습....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 연구의 실험은 8주에서 12주 사이의 총 10마리의 C57BL/6 마우스를 활용했습니다. 실험 작업은 쓰촨 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#201609309)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 기사에 사용된 실험 재료와 유세포 분석의 파라미터는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 마우스 골수 세포의 분리 및 수집
- 기관 지침에 따라 엄격하게 쥐를 안락사시킵니다. 마우스의 무의식을 유도하려면 2% 이소플루란으로 시작하여 흡입 마취제를 투여한 다음 호흡이 멈출 때까지 5% 이소플루란으로 복용량을 점진적으로 늘립니다.
- 수술실이나 흄 찬장에서 쥐를 해부하십시오. 70% 에탄올로 마우스를 세척하고 살균합니다.
- 날카로운 가위로 다리의 피부와 근육을 완전히 자르고 대퇴골을 절개합니다.
- 모르타르에 있는 그라인딩 로드로 대퇴골을 부드럽게 부수고 뼈가 하얗게 될 때까지 DMEM 배지로 골수 세포를 씻어냅니다.
- 얻어진 골수 세포를 100μm 필터로 15mL 튜브에 여과합니다. 800 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리기.
- 상층액을 버리고 1mL의 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 2에서 대조군은 Hoechst 33342의 제거를 방지하기 위해 줄기 세포의 ABC 수송체를 차단하는 베라파밀로 처리되었습니다. 이에 의해, non-verapamil 그룹의 줄기 세포는 Hoechst 33342를 배출하고 SP 세포로 알려진 음성 세포 집단을 형성합니다. 355nm 레이저는 Hoechst 33342 염료를 효과적으로 자극하여 골수의 SP 세포를 명확하게 관찰할 수 있었습니다(그림 2A). 355nm 레이저와 405nm 레이저로 검출한 동일한 샘플의 SP 셀은 본질적으로 동일한 것으로 나타났습니다(그림 2D).
그림 2와 그림 3에서 우리는 비전통적인 유량계의 다른 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리는 설명된 프로토콜을 사용하여 3-4마리의 마우스를 대상으로 각 실험을 수행하여 총 10개의 마우스를 생성했습니다. SP 세포의 비율은 0.05%에서 0.76% 사이였습니다. 마우스들 사이에서 개체별 변이가 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 우리는 Hoechst 샘플을 분석하기 위해 4개의 유세포 분석기를 사용했습니다. 새로운 버전의 유세포 분석에서 20mW 355nm 레이저에 의한 Hoechst 염료의 여기(excitation)는 구식 유세포 분석에서 100mW 355nm 레이저의 여기(excitation)와 동일한 것으로 관찰되었습니다. 이 현상은 두 시스템 모두에 사용되는 레이저 유형의 차이에 기인할 수 있습니다. 375nm 및 405nm 레이저의 관찰된 효과에 대한 잠재적인 이유는 애벌랜치 포토다이오드(APD) 검출기의 활용과 함께 두 레이저의 상당한 전력 출력에 기인할 수 있습니다. Hoechst Red-A 채널은 광전자 증배관(PMT)의 광전 변환 효율이 상대적으로 낮은 690nm의 적색에 가까운 장파장.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81800207)에서 J.H.에 대한 보조금으로 지원되었습니다. Beckman Coulter, Inc.가 유세포 분석 및 파라미터 보정을 지원하는 데 도움을 주시면 대단히 감사합니다. 유세포 분석 데이터 수집에 도움을 주신 쓰촨 대학교 West China Hospital of Stomatology의 State Key Laboratory of Oral Diseases의 Jiao Chen과 쓰촨 대학교 West China Hospital 재생 의학 연구 센터의 Yu Qi에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자동 셀 카운터 | Countstar | 1M1200 | |
| 셀 필터(100 &마이크로; m) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| 일일 품질 관리 형광구 | Beckman Coulter | B5230 | |
| Dulbecco의 4.5g/L 포도당(DMEM 배지)을 함유한 독수리 배지 변형 | CORNING | 10-013-CVRC | |
| 소 태아 혈청 | CORNING | 35-081-CV | |
| HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
| Hoechst 33342 | 시그마-알드리치 | B2261 | |
| 프로피듐 요오드화물 (PI) | 시그마-알드리치 | P4170 | |
| 적혈구 용해 완충액 | 베이요타임 | C3702 | |
| 베라파밀 | 시그마-알드리치 | V4629 |
참고문헌
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Zhou, S., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
