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Methodenartikel

Herstellung von nanofibrillär strukturiertem Kollagen für das Tissue Engineering

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DOI:

10.3791/67165

⸱

20. September 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das folgende Protokoll stellt ein scherbasiertes Extrusionsverfahren zur Herstellung von Kollagen-Hydrogelen mit nanoskaligen strukturierten Fibrillen vor, das auf eine breite Palette von Tissue-Engineering-Anwendungen angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Regenerative Biomaterialien wurden entwickelt, um Zell-Material-Interaktionen zu erleichtern und die Reparatur von geschädigten Geweben und Organen zu steuern. Diese Materialien sind so konzipiert, dass sie die biophysikalischen Eigenschaften von nativem Gewebe nachahmen und eine zelluläre phänotypische und morphologische Führung bieten, die zur Wiederherstellung der regenerativen Gewebenische beiträgt. Kollagen, ein weit verbreitetes Protein der extrazellulären Matrix, ist aufgrund seiner Biokompatibilität und anderer günstiger Eigenschaften ein häufiger Bestandteil dieser regenerativen Biomaterialien. Die vorliegende Studie beschreibt eine neuartige und unkomplizierte Methode zur Herstellung von künstlich hergestelltem nanofibrillärem Kollagen mit gerichteter Fibrillenstrukturierung. Durch die Manipulation von Scherspannung, Temperatur und pH-Wert werden die Kollagenfibrillogenese und -ausrichtung präzise gesteuert, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von nanofibrillären Kollagen-Biomaterialien, die die native Struktur von Geweben nachahmen, die entweder anisotrope oder isotrope Eigenschaften aufweisen. Die Flexibilität der Kollagen-Nanofibrillen-Strukturierung erleichtert nicht nur die Untersuchung der nanoskaligen Musterbildung auf das Zellverhalten, sondern bietet auch vielfältige Möglichkeiten für strukturierte Tissue-Engineering-Anwendungen.

Einleitung

Das Ziel der regenerativen Medizin ist es, die Geweberegeneration und -heilung durch die Anwendung von technisch hergestellten Therapeutika zu verbessern. Ein Ansatz besteht darin, Biomaterialkonstrukte herzustellen, die die Zusammensetzung und Struktur nativer Gewebe genau nachahmen. Bei der Entwicklung dieser Konstrukte ist die native zugrundeliegende extrazelluläre Matrix (ECM) von entscheidender Bedeutung, die Instruktionshinweise für die Zellproliferation, -migration und -differenzierung liefert und letztendlich die Geweberegeneration vorantreibt 1,2. Die native EZM besteht überwiegend aus fibrillärem Kollagen 3,4. In hochorganisierten Geweben wie Skelettmuskulatur und Sehne weisen diese ECMs eine ausgerichtete Musterung auf, die für die Unterstützung der Kraftübertragung im Gewebe sowie der motorischen Funktion von entscheidender Bedeutung ist 5,6.

Der Nutzen von Kollagen als Biomaterial für Tissue-Engineering-Anwendungen geht über seine umfangreiche Prävalenz in nativen Geweben hinaus, da es auch eine gute Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit und Zellaffinität aufweist 7,8,9. Jüngste Fortschritte bei der Entwicklung von biomaterialien auf Kollagenbasis haben sich auf die Verfeinerung der biophysikalischen Eigenschaften konzentriert, um die mechanischen und biochemischen Signale, die für die spezifische Geweberegeneration unerlässlich sind, besser zu steuern. Die Herstellung von Kollagen-Biomaterialien mit einer fibrillären Struktur in vitro ist relativ einfach, da säurelösliche Kollagenmoleküle in der Lage sind, sich selbst zu Nanofibrillen zu organisieren, wenn sie warmen Temperaturen und einem neutralen pH-Wertvon 10,11 ausgesetzt werden. Ohne geführte Manipulation bilden sich diese Fibrillen jedoch zu zufälligen Netzwerken, was sie für anisotrope Tissue-Engineering-Anwendungen ungeeignet macht. Techniken, die in der Lage sind, ausgerichtete Fibrillen herzustellen, umfassen das Elektrospinnen und das Nassspinnen zusammen mit anderen Lösungsextrusionstechniken12,13, Gefriertrocknung14, elektrochemischer oder magnetischer Herstellung15,16, Scherflussabscheidung17, strömungsinduzierte Kristallisation18, Gelextrusion19, dehnungsinduzierte Ausrichtung20 und kraftgeführte Ausrichtung durch Manipulation von Flüssigkeit Durchfluss 21,22. Viele dieser Methoden sind jedoch entweder nicht sehr gut mit Kollagen kompatibel, erzeugen eine Ausrichtung auf der Mikroskala, aber nicht auf der Nanoskala, erfordern zusätzliche Nachbearbeitungsschritte, um die Ausrichtung und Stabilität zu induzieren, oder erfordern hochspezialisierte Geräte und Reagenzien, was ihre breite Einführung schwierig macht.

Die vorliegende Studie stellt eine einfache scherbasierte Methode zur Herstellung von nanofibrillärem Kollagen vor, mit ausgerichteter oder zufällig orientierter Fibrillenstrukturierung, ohne dass spezielle Geräte wie Spritzenpumpen oder Elektrospinner erforderlich sind. Diese Technik macht sich die pH-Abhängigkeit der Kollagenfibrillogenese zunutze. Die Anwendung von Scherkraft auf saures monomeres Kollagen in einem neutralisierenden Puffer fördert die ausgerichtete Fibrillogenese entlang der Scherrichtung. In ähnlicher Weise kann Kollagen dazu gebracht werden, in Abwesenheit von Scherung eine Fibrillogenese zu durchlaufen, wodurch Fibrillen mit zufälligen Mustern entstehen. Die resultierenden 3D-Kollagenstreifen, die entweder aus ausgerichtetem oder zufällig gemustertem nanofibrillärem Kollagen bestehen, können als Werkzeuge dienen, um die Auswirkungen der nanoskaligen Musterbildung auf das Zellverhalten zu untersuchen. Darüber hinaus bieten sie vielfältige Möglichkeiten sowohl für anisotrope als auch für isotrope Tissue Engineering-Anwendungen 23,24,25,26,27. Die Musterung kann angepasst werden, um der Struktur des nativen Gewebes von Interesse zu entsprechen. Die Kollagenstreifen können auch zu unterschiedlich großen Bündeln kombiniert werden, um als transplantiertes technisches Therapeutikum bei verschiedenen Größen und Formen von Verletzungen zu dienen.

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Protokoll

1. Zubereitung von dialysiertem Kollagen (Abbildung 1)

  1. Schneiden Sie den Dialyseschlauch auf eine Länge von ca. 3 Zoll. Verwenden Sie Schläuche mit den folgenden Spezifikationen: 32 mm flache Breite, 20 mm aufgeblasener Durchmesser und 4,8 nm Porengröße.
  2. Rehydrieren Sie Dialyseschläuche in Reinstwasser.
  3. Klemmen Sie ein Ende des Schlauchs mit einem Dialyseschlauchclip ab.
  4. Übertragen Sie 5-6 ml Rattenschwanzkollagen Typ I (Konzentration: 9-10 mg/ml in 0,02 N Essigsäure) mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer 18-g-Nadel ausgestattet ist, in den Schlauch. Clipsen Sie das andere Ende des Schlauchs ab, um ihn zu schließen.
  5. Legen Sie eine 0,5 bis 1 cm dicke Schicht Polyethylenglykol (PEG)-Flocken auf den Boden einer Glasschale und legen Sie dann den mit Kollagen gefüllten Dialyseschlauch auf die PEG-Schicht.
    HINWEIS: Eine 13 Zoll x 9 Zoll x 2 Zoll große Glasschale kann in der Regel eine Reihe von 4-5 mit Kollagen gefüllten Röhrchen aufnehmen. Die Schalengröße kann je nach benötigtem Kollagenvolumen angepasst werden.
  6. Fügen Sie weitere PEG-Flocken hinzu, um den Schlauch vollständig zu bedecken, und stellen Sie das Tablett in einen 4 °C Kühlschrank.
  7. Entfernen Sie alle 10-15 Minuten die feuchten PEG-Flocken von der Oberfläche des Dialyseschlauchs und bedecken Sie den Schlauch erneut mit einer frischen Schicht trockenem PEG. Stellen Sie das Gericht wieder in den 4 °C Kühlschrank.
  8. Wiederholen Sie Schritt 1.7 noch zwei weitere Male und spülen Sie nach 30-35 min die feuchten PEG-Flocken mit Leitungswasser ab.
  9. Spülen Sie den Schlauch noch einmal mit Reinstwasser ab und tupfen Sie den Schlauch mit einem Taschentuch trocken.
  10. Lösen Sie ein Ende des Schlauchs und überführen Sie das dialysierte Kollagen (Endkonzentration: ~30 mg/ml) in Mikrozentrifugenröhrchen. Luftblasen im Kollagen mit einer Mini-Zentrifuge (2.000 x g, ≤30 s, Raumtemperatur [RT]) kurz herunterschleudern und für die spätere Verwendung bei 4° C lagern.
  11. Laden Sie das Kollagen einen Tag vor der Anwendung in Spritzen.
    1. Ziehen Sie mit einer 16-Gauge-Nadel ~1 ml dialysiertes Kollagen in eine 1-ml-Spritze auf.
      HINWEIS: Kollagen ist eine viskose Substanz. Der Nadelkopf muss möglicherweise mit Kollagen vorgeladen werden, bevor mehr Kollagen aufgenommen werden kann. Entfernen Sie den Nadelkopf und stoßen Sie bei Bedarf große Lufteinschlüsse aus
    2. Entfernen Sie die Nadel und wickeln Sie den Spritzenkopf mit Parafilm ein.
    3. Lagern Sie die mit Kollagen gefüllte Spritze aufrecht bei 4° C über Nacht, damit kleine Luftblasen platzen können.

2. Vorbereitung der Glassplitter ( Abbildung 1)

VORSICHT: Verwenden Sie für diesen Teil des Protokolls einen Augenschutz.

HINWEIS: Für Zellkulturexperimente werden speziell beschichtete hydrophobe Glasobjektträger verwendet. Die Rutschen müssen an den Kanten angefasst werden, um ein Entfernen der Oberflächenbeschichtung zu verhindern. Führen Sie den Glaszuschnitt auf einer geeigneten Schneidunterlage durch.

  1. Messen und markieren Sie die gewünschten Abmessungen des Glaschips mit einem Permanentmarker
    1. Wenn Sie 8-Stab-Gerüste erstellen, markieren Sie ca. 1 cm große Schritte entlang der langen Kante der Folie. Passen Sie die Abmessungen nach Bedarf basierend auf der gewünschten Gerüstgröße an.
  2. Gleiten Sie mit einer geraden Kante (d. h. einer 6-Well-Plattenkante) mit dem Glasschneider über die Länge der ersten Messung, um das Glas zu ritzen.
  3. Der Objektträger bricht entweder von selbst entlang der gekerbten Linie oder dreht den Objektträger auf ein Gewebe (hydrophobe Seite nach unten) und übt manuell Druck auf den eingeritzten Bereich aus.
  4. Markieren Sie die beschichtete Seite des hydrophoben Objektträgers mit einem Ethanol-Markierungsstift.
  5. Spülen Sie den Glaschip mit Reinstwasser ab, um Glasstaubreste zu entfernen.
  6. Trocknen Sie die Glasspäne entweder mit einer Tischdüse für Druckluft oder indem Sie sie schräg im Abzug stapeln.
  7. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, um die erforderliche Anzahl von Chips zu erreichen. Lagern Sie die Chips bei RT. Für beste Zellkulturergebnisse verwenden Sie vorbereitete Chips innerhalb von 7 Tagen.

3. Herstellung von 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)

  1. Füllen Sie eine Glasflasche mit 500 mL Reinstwasser.
  2. Geben Sie 10 PBS-Tabletten in die Flasche.
    HINWEIS: Dieses Protokoll geht davon aus, dass das Tablettenverhältnis für 1x PBS 1 Tablette pro 500 ml beträgt. Passen Sie die Anzahl der Tablets nach Bedarf an, wenn Sie eine andere Tablet-Größe oder -Marke verwenden.
  3. Geben Sie einen Rührstab in die Flasche und legen Sie ihn auf eine Rührplatte, bis sich die Tabletten aufgelöst haben.
  4. Übertragen Sie am Tag der Hydrogelherstellung das benötigte Volumen von 10x PBS auf konische 50-ml-Röhrchen.
  5. Legen Sie die PBS-gefüllten Röhrchen vor der Kollagenherstellung mindestens 15 Minuten lang in ein 37 °C heißes Wasserbad.

4. Herstellung von ausgerichteten Kollagen-Nanofibrillen (Abbildung 2)

  1. Nehmen Sie eine Spritze mit Kollagen aus dem Kühlschrank und befestigen Sie eine stumpfe 22-G-Nadel.
  2. Legen Sie einen Objektträger in den Deckel einer 4-Well-Platte.
  3. Decken Sie den Objektträger mit ausreichend erwärmtem 37 °C 10x PBS ab, um ihn einzutauchen (30-50 mL).
  4. Halten Sie die Spritze in einem Winkel von etwa 30-45° und extrudieren Sie dünne Kollagenstreifen manuell mit einer Geschwindigkeit von ~340 mm/s und einer Flussrate von ~3,2 mL/min auf den Glaschip.
    HINWEIS: Schließen Sie die Kollagenextrusion innerhalb von 30-60 s nach Zugabe des erwärmten PBS ab, um sicherzustellen, dass das PBS nicht übermäßig abkühlt.
  5. Warten Sie 1-2 Minuten, damit das Kollagen die Fibrillogenese abschließen kann oder bis das Kollagen eine undurchsichtige weiße Farbe annimmt.
  6. Schneiden Sie die Kollagenstreifen mit einer Pinzette auf Länge ab. Stellen Sie sicher, dass die Streifen lang genug sind, damit 3-5 mm unter beiden Enden des Chips gefaltet werden können.
  7. Legen Sie die Kollagenstreifen nacheinander vorsichtig der Länge nach (parallel zum eingeritzten Bereich) über einen vorbereiteten Glaschip. Stecken Sie die Kanten unter den Chip.
  8. Fahren Sie mit dem Platzieren von Kollagenstreifen fort, bis die gewünschten Abmessungen erreicht sind.
  9. Positionieren Sie das neu gebildete Kollagen-Hydrogel in zwei Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Dies ermöglicht eine Luftzirkulation während des Trocknungsprozesses und verhindert, dass die Enden des Kollagens an unerwünschten Oberflächen haften bleiben.
  10. Lassen Sie die Hydrogele 1-3 Stunden lang auf der Tischplatte trocknen oder bis PBS-Salzkristalle 50 % bis 90 % der Hydrogeloberfläche bedecken.
    HINWEIS: Die Trocknungszeit hängt von der Größe des Hydrogels und dem Vorhandensein von überschüssiger Flüssigkeit ab.
  11. Tauchen Sie jedes Hydrogel für ca. 30-60 s in 1x PBS ein oder bis sich die Salzkristalle aufgelöst haben.
  12. Tupfen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Taschentuch ab.
  13. Legen Sie die Hydrogele wieder auf die Vertiefungsplatte und lassen Sie sie über Nacht in einem Abzug trocknen.
  14. Lagern Sie die getrockneten Hydrogele ca. 1 Woche bei RT.

5. Herstellung von zufälligen Kollagen-Nanofibrillen (Abbildung 3)

  1. Nehmen Sie eine Spritze mit Kollagen aus dem Kühlschrank und befestigen Sie eine stumpfe 22-G-Nadel.
  2. Extrudieren Sie Kollagen mit ~3,2 mL/min auf einen trockenen Glaschip. Extrudieren Sie genügend Kollagen, um ähnliche Abmessungen wie die ausgerichteten Kollagen-Hydrogele zu erhalten. Verhindern Sie bei Bedarf die Ansammlung von Luftblasen.
  3. Extrudieren Sie zusätzliches Kollagen, um es um die Ränder des Glaschips zu wickeln. Dadurch wird das Risiko eines versehentlichen Ablösens minimiert.
  4. Tauchen Sie das extrudierte Kollagen mit einer Pinzette in ein 50-ml-Röhrchen mit erwärmtem 10x PBS.
  5. Warten Sie 45-60 s, bis das Kollagen die Fibrillogenese abgeschlossen hat oder bis das Kollagen eine undurchsichtige weiße Farbe annimmt.
  6. Tupfen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Taschentuch ab.
  7. Führen Sie die Schritte 4.9-4.14 aus, um die Hydrogele zu spülen und zu trocknen

6. Sterilisation und Rehydrierung

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank aus

  1. Sterilisieren Sie die Kollagen-Hydrogele und die umgebende Well-Platte 15 Minuten lang in 70%igem Ethanol.
    1. Heben Sie die Hydrogele nach der Hälfte der Sterilisation mit einer Pinzette kurz an, um sicherzustellen, dass sowohl die Unterseite des Glaschips als auch das Hydrogel mit Ethanol in Kontakt kommen.
  2. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie die Hydrogele 10 Minuten lang an der Luft trocknen.
  3. Waschen Sie die Hydrogele 3 Mal in sterilem 1x PBS für jeweils 10 Minuten, um Ethanolreste zu entfernen und die Hydrogele zu rehydrieren. Hydrogele sind nun gebrauchsfertig (Zellkultur, etc.). Hydrogele können nach dem letzten Waschschritt kurz in PBS belassen werden, wenn sie nicht sofort gebrauchsfertig sind.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache scherbasierte Extrusionstechnik zur Herstellung von Kollagen-Hydrogelen, die entweder aus ausgerichteten (Abbildung 2) oder zufällig (Abbildung 3) orientierten Nanofibrillen bestehen. Die Strukturierung von Nanofibrillen beruht auf der präzisen Steuerung der Scherkräfte, die durch die kombinierte Modulation der Spritzengeschwindigkeit und der Kollagenextrusionsrate erreicht wird. Optimale Werte für die Induktion der Fibr...

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Diskussion

Die kritischen Schritte des Protokolls lassen sich in drei Hauptteile unterteilen: 1) Kollagenfibrillogenese, 2) Hydrogel-Einbettung und 3) Waschen. Der Prozess der Kollagenfibrillogenese findet spontan unter neutralisierenden Bedingungen statt und beruht auf der Selbstorganisation einzelner Kollagenmoleküle zu größeren stabilisierten fibrillären Strukturen10,11. Dies wird durch die Anwendung eines neutralisierenden gepufferten M...

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Offenlegungen

Es gibt keine Interessenkonflikte, die deklariert werden müssen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde zum Teil durch Mittel der Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, der Oregon Health & Science University Foundation und des Collins Medical Trust unterstützt. K.M.H. wurde unterstützt durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1937961) und das Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) Fellowship (5TL1TR2371-8). K.H.N. wurde durch Zuschüsse des NIH/NHLBI (R00HL136701) und des NIH/NIAMS (R01AR080150) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kollagen I, hohe Konzentration, RattenschwanzCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U MikroskopNikonTE-2000-U Inverses Mikroskop
Extra dicke ObjektträgerFisher Scientific22-267-005Eignet sich gut für Kollagenextrusionsoberflächen
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/ARasterelektronenmikroskop
Glasschneider Werkzeugsatz 2mm-20mm Pencil Style Oil Feed HartmetallspitzeAmazon/MOARMOR B07Y1D243HOption für einen
Glasschneider Hamilton Kel-F Hub Blunt Point Nadeln (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Nadeln für die Kollagenextrusion
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Hydrophobe Objektträger
PBS TablettenThermo Fisher Scientific18912014
Polyethylene Glycol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Nahtlose Cellulose-Dialyseschläuche Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Dialyse-ClipsThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware GlasschneiderSynthware31-501-927Option für einen Glasschneider

Referenzen

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