הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

Summary

אנו מתארים שיטה להכנת דנ"א כדורים מצופים זהב להדגים את השימוש בכדורים כאלה biolistically transfect נוירונים בהיפוקמפוס פרוסות תרבותי.

Abstract

Transfection Biolistic הוא אמצעי פיזי של transfecting תאים על ידי מפציצים גבוהה רקמה עם דנ"א חלקיקים מהירות מצופה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור transfection biolistic של פרוסות בהיפוקמפוס חולדה, החל בהכנה הראשונית של ה-DNA כדורים מצופים לירי הסופי של תרבויות פרוסה organotypic באמצעות אקדח גנים. אקדח transfection Gene הוא אמצעי יעיל וקל של transfecting נוירונים שימושית במיוחד fluorescently תיוג חלק קטן של תאים ורקמות פרוסה. בסרטון הזה, אנחנו הראשונים מתאר את הצעדים הנדרשים כדי חלקיקי זהב מעיל עם ה-DNA. אנחנו הבא להדגים כיצד לקו הפנימי של צינורות פלסטיק עם כדורי זהב / DNA, כיצד לחתוך את צינורות כדי להשיג את מחסניות פלסטיק עבור טעינת אקדח לתוך הגן. לבסוף, אנו מבצעים transfection biolistic של תרבויות עכברוש בהיפוקמפוס פרוסה, הוכחת טיפול של ביו רד הליוס אקדח גן, ומציעים ייעוץ ירי צרות לקבל פרוסות רקמה בריאה transfected בצורה אופטימלית.

Protocol

פרוטוקול transfection BIOLISTIC

הכנת כדורי

כדורים טובים עד 6 חודשים, אך עלול להתחיל ירידה יעילות transfection לאחר 2-3 חודשים. תבליטים צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות כדורי dessicant. תמיד להניח צלוחיות הנצנץ, שבו הכדורים מאוחסנים, חם לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוקון.

לפני תחילת העבודה יש ​​להכין:

• Spermidine (0.05M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100% גבוהה כיתה בקבוק סגור)
• Autoclaved H ₂ 0
• דנ"א להיות transfected
• Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 מ"ג / מ"ל ​​המלאי)
• 2 X 15 מ"ל חרוטי (2/bullet סט)
• Tubing (חתך לתוך 1 X ~ 30 אינץ' / להגדיר כדור)
• Scintillation בקבוקונים (סט 1/bullet)
• התייבשות כדורי
• 10 מ"ל מזרק w / צינורות בצד

הכן צינורות:

1. יבש ~ 30 אינץ' של צינורות (בערך 2 ס"מ מעבר הרחבת זכות O-Ring) בתחנת צינורות w / N ₂ גז (0.4 הלחץ) למינימום של 20 דקות.

מזרז DNA על חרוזי זהב:

1. הכן את ה-DNA כדי להיות transfected בנפח 50 סך μmL בצינור microcentrifuge (50 מיקרוגרם לכל היותר DNA הכולל)
2. לשקול את 6-8 מ"ג של זהב להעביר צינור microcentrifuge
3. הוספת 100 μL של spermidine 0.05M אל זהב sonicate עבור 20 שניות
4. מוסיפים את μL 50 של ה-DNA של זהב / spermidine
5. וורטקס (סביב הגדרת 5) w / מכסה פתוח
6. הוסף ירידה μL חכם של 100 1M CaCl ₂
7. Sonicate בקצרה (<5 שניות)
8. אפשר לזרז עבור 10 דקות ב temp חדר
9. Sonicate בקצרה

הכן פתרון PVP במהלך sonication:

1. הפוך את לדלל פתרון PVP ב 15 מ"ל חרוטי, 3.5mL לדלל PVP עבור כל קבוצה של כדורים (להוסיף 7.5 μL של המניה PVP 20mg/ml ל -3.5 מ"ל EtOH 100%)

שטיפה עם חרוזי זהב EtOH:

1. ספין למטה חרוזי זהב במלוא המהירות על 10 שניות ב microcentrifuge
2. בטל supernatant, אבל לשמור על כמות קטנה של נוזל על גבי חרוזי זהב
3. לשטוף 3X עם 1ml EtOH, sonicate בקצרה בכל פעם, אם יהיה צורך

Resuspend זהב / DNA בתמיסה PVP:

1. Resuspend גלולה זהב μL 200 של פתרון 3.5 מ"ל PVP / EtOH לדלל
2. מערבולת כדורית הזהב resuspend (בקצרה sonicate במידת הצורך)
3. מעבירים את μL 200 זהב / פתרון ל PVP חדש 15 מ"ל חרוטי
4. המשך בדרך זו, והוסיף 200 μL של PVP בכל פעם עד שכל הזהב הועבר 15 מ"ל חרוטי, ואת הנפח הסופי הוא 3.2 מ"ל

ציפוי צינורות:

1. בטל N ₂ בתחנת צינורות ולהסיר צינורות יבשים
2. צרף צינורות יבשים מזרק 10 מ"ל
3. בתוקף לנער את 15 מ"ל חרוטי מלא זהב / PVP
4. הנח את קצה הצינורית זהב / פתרון PVP ולמצוץ לאט להיות זהיר, כדי למנוע בועות
5. השאר ~ 2 אינץ' יבש משני הקצוות של הצינור
6. עם צינור המחובר עדיין מזרק מלא פתרון זהב / PVP, בזהירות המקום בחזרה צינורות לתוך התחנה
7. סמן את קצות צינורות שבו פתרון יושב
8. בואו הזהב להסתפק 5 דקות עם מזרק המצורף
9. תמצצי-up הפתרון לאט מאוד על ידי משיכת את המזרק כך התיישבו זהב הוא נשאר מאחור (לוודא שלא לשטוף גב)
10. נתק את המזרק
11. סובב 90 ° ולתת לשבת 2 שניות
12. סיבוב 180 מעלות ולתת לשבת עוד 2 שניות
13. סיבוב הצינור למשך 5 שניות
14. הפעל את N ₂ שסתום כך נכתב בין 0.4-0.5 ו - ספין בצינור מצופה זהב תוך ייבוש דקות 5.

חיתוך צינורות:

1. הסר את צינורות מתחנת-הכנה בצינור וכיבה את ומסתיים הסימנים.
2. שים בקבוקון scintillation מתויג תחת המסוק צינורות לתפוס מחסניות לחתוך
3. המקום צינורות במסוק צינורות וחתך את צינורות עם סכין נקי
4. מניחים כדורי התייבשות בבקבוקון scintillation
5. אחסן מחסניות ב 4 ° C

קליעה Slices רקמות

בעת הירי פרוסות בתרבית, חשוב להעסיק טכניקה סטרילי יחסית, כדי למנוע זיהום. זכור, כי בעת הירי בשני דגמים שונים, שתי קבוצות של כדורים ניתן לטעון לתוך המחזק את המחסנית זהה, אך חבית אניה המסך צריך להיות שונה בין המבנים.

לפני תחילת העבודה יש ​​להכין:

• ה-DNA כדורים (שלא בקבוקון scintillation חמים לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה)
• רקמות פרוסות
• הליוס Gene Gun
• מיכל הליום עם צינור אקדח גן מצורף </ Li>
• טונר בעל
• אניה חבית פלסטיק עם O-Ring במקום
• מפזר (שינה)
• מפזר מסך
• מצבטים

Prepping את האקדח הגן:

1. מלקחיים שימוש במקום מחסניות פלסטיק מצופה זהב לתוך המחזק את המחסנית.
2. המקום בעל מחסנית לתוך אקדחו הגן על ידי הראשון להדוף לנעול
3. Secure בעל מחסנית עם מנעול
4. השג אניה חבית עם טבעת-O ואת המסך מפזר בבטחה במקום
5. בורג חבית אניה לתוך האקדח גן

קליעה פרוסות תרבותי עם אקדח הגן:

1. לשים על אטמי אוזניים
2. הכנס את האקדח לתוך הגן מחובר טנק צינור גז הליום
3. הפעל את הלחץ על הטנק PSI 180
4. תירה ריק לאוויר על מנת להסיר כל אבק או פסולת מן המסך מפזר. כדי לירות באקדח, תחילה לדכא את לחצן בטיחות משתלבים עד צפצופים אקדח, ואז ללחוץ על ההדק.
5. לאחר הירי ריק, להסיר את פרוסות מן החממה
6. מראש אקדח תחילה לבנות
7. תירה עם המסך מפזר על 0.5-1 ס"מ מן הפרוסה
8. מראש את מחסנית בין בארות.
9. לאחר הירי גם האחרון, במקום פרוסות בחזרה לתוך החממה
10. כבה את לחץ הגז ולשחרר לפני ניתוק את האקדח מן הצינור הליום
11. הברג החוצה את אניה לחבית, ולהסיר את מחסנית הפגזים בשימוש

ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית:

1. המקום מחסניות, ספינות לחבית, מסכי מפזר בכוס עם מים וסבון
2. מניחים כוס ב sonicator אמבטיה sonicate עבור 20 דקות
3. ביסודיות לשטוף עם מים עד שכל שאריות סבון יוסרו
4. משרים EtOH 70% למשך שעה
5. מניחים על מגבת נייר יבשה לילה יבש
6. מחסניות נקי, ספינות לחבית, מסכי מכן ניתן לעשות שימוש חוזר transfections biolistic הבאים

הירי צרות טיפים transfection Biolistic

Transfection Biolistic יכולה לפעמים לגרום transfection תנאים טובים. זה יכול להוביל מעט מדי או יותר מדי תאים רבים transfected, גבוה מדי או נמוך מדי רמות הביטוי, או עלול לגרום פרוסות הרקמה להיות בריא בדרך כלל. לעיתים קרובות התוצאה פרוסות בריא מהפיצוץ את הלחץ. הנה כמה טיפים כדי לקבל פרוסות הרקמה transfected בצורה אופטימלית.

אם פרוסות להיראות בריא (או אם תאים רבים מדי transfected / פרוסה), נסה:

• הירי הגדלת מרחק
• הפחתת הלחץ על מיכל הדלק
• הפחתת כמות זהב
• לחתוך החוצה את מרכז מפזר Bio-Rad והחלפת מרכז עם מסך מפזר.

אם תאים מעטים מדי הם transfected, נסה:

• הקטנת מרחק הירי
• לחץ הולך וגובר על מיכל הדלק
• הגדלת כמות של זהב
• הגדלת מספר פרוסות הרקמה / טוב
• לוודא O-Ring ב-לחבית אניה לא נפגע.

אם אתה לקבל פרוסות עם שני תאים רבים מדי, מעט מדי transfected במהלך הירי באותו לוודא:

• כי אתה מחזיק את האקדח באופן סימטרי מעל היטב
• זהב כי היא שווה הציפוי הפנימי של צינורות. (אם אתה מקבל שורה של זהב, למשוך את supernatant מן הצינור בקצב מהיר פעם זהב יש התיישבו וסובב את הזהב כבר לפני הפעלת חנקן. אם, מצד שני, אתה מקבל פסים של זהב , זה צפוי עקב חשיפה לחות רבה מדי במהלך ביצוע כדור: ודא שאתה משתמש בקבוק סגור של EtOH, כי צינורות הוא יבש לחלוטין לפני הציפוי, וכי אתה מכסת מכסים הכנת כדורי מבעוד מועד).

אם יעילות transfection נראה אופטימלי (# תאים transfected / פרוסה), אך רמת הביטוי נראה גבוה מדי או נמוך מדי:

• להתאים את ה-DNA יחס זהב. (למשל, אם הוא נמוך מדי לשמור על כמות של זהב אלא להגדיל את כמות ה-DNA).
• להתאים את כמות הזמן בין ירי ואיסוף נתונים

במקרה של transfection כפול, אם אתה מקבל ביטוי מעט מדי של אחד המבנים שלך, לשנות את היחס בין שני המבנים באופן המתאים וודא בונה הן תחת מקדם אותו, כדי לוודא שאף אחד היזם לא יהיה מחוץ להתחרות השני.

Discussion

Transfection Biolistic הוא אמצעי פיזי של transfecting תאים באמצעות הפגזה של רקמה חיה גבוהה עם ה-DNA מהירות החלקיקים מצופה זהב. ב העברת גנים בתיווך חלקיקים, תאים transfected כללי התוצאה כאשר הכדור מגיע לנוח בגרעין. בעוד רבים transfection שיטות שונות קיימות, כגון, microinjection lipofection, electroporation סידן פוספט, transfection ו transfection ויראלי, transfection biolistic יכולים להציע עבודה פחות אינטנסיבית, חלופה יעילה transfecting תאים שאינם transfected בקלות באמצעות שיטות אלה אחרים. למעשה, זה פותח לראשונה כטכניקה להעברת גנים בצמחים מאז נוכחות של התא הקיר עשוי transfection קשה בשיטות קודמות ^1. באופן דומה, biolistics צברה פופולריות בתחום הנוירוביולוגיה מאז הפוסט mitotic הנוירונים קשה לשמצה transfect ^2,3. בפרט, זוכה להכרה רחבה כטכניקה העיקרון לשמש בניסויים שמטרתם להעריך מורפולוגיה קנס של נוירונים בודדים פרוסות המוח ללא פגע. השיטות שתוארו כאן לספק הסבר מפורט ומקיף של כיצד לבצע transfection biolistic של פרוסות המוח בתרבית באמצעות כף יד גן ירייה (הליוס Gun ג'ין המערכת; Bio-Rad).

Transfection Biolistic הפכה השיטה המועדפת transfecting נוירונים בתרבית פרוסה משום שהוא מאפשר transfection של מספר מועט של תאים פרוסה ברחבי המוח. בדרך זו, נוירונים בודדים יכולים להיבחן במנותק. מאז הטכניקה הזו הוא גם מתאים במיוחד עבור transfecting הנוירונים במוח פרוסה, הוא משמש לעיתים קרובות בשילוב עם מיקרוסקופיה 2-פוטון, מאז להדמיה 2-פוטון מאפשר עירור של תאים שכותרתו fluorescently עמוק בתוך רקמת פיזור אור ^4. אכן תמונות בהגדלה גדולה של נוירונים פירמידליים יחיד שהוצגו ברחבי וידאו זה נלכדו באמצעות אישית בנוי 2-פוטון מיקרוסקופ סריקת לייזר. ב transfection biolistic המסקנה היא אמצעי יעיל transfecting תאים בודדים בתוך ההקשר של צפיפות גבוהה של תאים המקיפים, וככזה הוכיחה מאוד שימושי עבור fluorescently תיוג נוירונים בודדים בתרבות פרוסה עצביים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).