一种用于慢性脑成像的开颅手术操作流程

摘要

本视频和实验方案演示了如何在啮齿类动物中植入玻璃覆盖的颅窗。此类制备可用于长期活体双光子成像，对新皮层进行数月时间尺度的观察。该方法也可用于其他类型的成像，包括光学内在信号成像。

摘要

成像技术在脑功能研究中正变得愈发重要。其中，双光子激光扫描显微镜已成为一种极为有用的方法，因为它能够用于研究活体完整大脑。通过适当的准备，该技术可实现对同一皮层区域从数分钟至数月的长期观察。在本视频中，我们展示了一种利用双光子显微镜进行脑部长期活体成像的制备方法。该技术最初由现任职于珍利亚农场研究园区的霍华德·休斯医学研究所研究员Karel Svoboda博士率先建立。类似本视频所示的制备方法可用于新皮层结构的成像（例如树突和轴突动态）、利用钙敏感性染料记录神经元活动、皮层血流动力学成像，或用于内在光学成像研究。通过优化的颅窗手术，可实现对新皮层的深层成像。为避免感染，手术应尽可能在无菌条件下进行，同时需格外小心以避免损伤硬脑膜，从而成功制备可长期维持的玻璃覆盖颅窗。

方案

1. 麻醉小鼠 使用经IACUC批准的操作程序，以异氟烷（诱导浓度4%，手术维持浓度1.5-2%）进行麻醉。必须通过尾部和/或脚趾夹捏反应来确认动物已完全进入镇静状态。
2. 使用啮齿类动物修剪器，将从颈部背部至眼睛区域的毛发剃除。
3. 放置 将小鼠固定于立体定位架中，置于手术用水循环加热毯上。用耳杆牢固固定头部。
4. 涂抹眼药膏，以防止动物眼睛干涩。
5. 皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）以预防脑肿胀，以及卡洛芬（5 mg/kg）以预防炎症反应。
6. 手术开始前，使用70%酒精和碘伏交替擦拭皮肤三次，对术区进行消毒。
7. 所有手术器械均已使用玻璃珠灭菌器预先灭菌。用经乙醇灭菌的剪刀去除颅骨顶部的皮肤，首先沿头部基底做一水平切口，接着向头侧方向做两个切口，几乎到达眼睑处，然后做两个在中线处汇合的斜向切口。
8. 一滴利多卡因+肾上腺素溶液 此时应施加于骨膜上，以避免过度出血或疼痛。使用手术刀将骨膜剥离至颅骨边缘。  同时，轻轻牵拉颈部后方的肌肉组织。
9. 用手术刀轻轻刮擦颅骨的整个暴露区域，以形成干燥的表面。此步骤非常关键，因为这将有助于后续涂抹的胶水更好地粘附。
10. 选定成像位置后，即可开始制备颅窗。首先，轻柔地“勾画”出 使用气动牙科钻头钻出直径约4 mm的圆形区域。
11. 轻微钻孔后，再次将利多卡因+肾上腺素溶液涂抹于颅骨表面。当仅剩极薄一层骨质时，停止钻孔。通过轻压颅骨开窗中心区域，感受其是否已可轻微下陷，通常可据此判断是否达到此阶段。
12. 在盐水滴下，利用骨小梁（骨的海绵状结构），用极细尖的镊子将颅骨切片从颅骨上抬起。盐水至关重要，因为它有助于抬起颅骨并防止硬脑膜出血。
13. 将先前用生理盐水浸泡过的明胶海绵敷于硬脑膜上，以止住去颅骨时偶尔出现的少量出血。
14. 在干燥硬脑膜表面并确认无出血后，轻轻地将一片无菌的5 mm玻璃盖玻片置于硬脑膜上方。注意：其他研究组还在硬脑膜上覆盖一滴低熔点琼脂糖（1.2%），然后将盖玻片置于琼脂糖之上。
15. 应用 在颅骨对侧半球滴加一滴氰基丙烯酸酯胶水。借助针头轻轻施加 在窗周涂抹胶水时需小心，避免将胶水置于玻璃下方。现在可将胶水以薄层均匀涂布于整个颅骨表面。
16. 胶水干燥后，混合牙科丙烯酸树脂并将其涂抹 在整个颅骨表面涂抹，同时覆盖盖玻片边缘的一小圈区域，以固定盖玻片。
17. 盖上盖玻片后，用牙科丙烯酸树脂在窗口周围制作一个小凹槽，并同时嵌入一个 在牙科丙烯酸树脂中放置一根钛棒。该钛棒之后将用于将小鼠牢固地固定在显微镜载物台上进行成像。确保钛棒处于水平状态非常重要，以便其与颅窗平行。在钛棒下方放置一张纸片，可使钛棒在丙烯酸树脂硬化过程中保持水平。
18. 牙科丙烯酸树脂需固化（硬化）10分钟， 此时钛棒已固定到位。将动物置于温暖的笼子中，直至其恢复。
19. 麻醉恢复后，当天即可对动物进行成像。

讨论

正如我们在视频和补充图中所示，结合双光子显微镜使用的颅窗制备技术是一种在活体中研究新皮层结构与功能的强有力工具。该技术需要经过严格训练，以熟悉相关的解剖结构以及制备过程中所需的精细外科操作与技能。只有手术质量极佳的样本才可用于慢性成像。如果硬脑膜被过度操作或穿破，则不应将其用于成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卡洛芬（Rimadyl）	药物	Pfizer Pharma GmbH
异氟烷（Aerrane）	手术	Baxter Internationl Inc.
地塞米松	药物	Baxter Internationl Inc.
Ortho-Jet 粉剂	试剂	LANG		需与丙烯酸混合使用
Jet-Acrylic 液体	试剂	LANG		需与 Ortho-Jet 粉剂混合使用
圆形玻璃盖玻片	工具	Electron Microscopy Sciences	72195-05	直径 5 mm
明胶海绵（Gelfoam）	手术	Pharmacia Corporation (Pfizer)
钛棒为定制产品