本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。共3部分，第1部分。
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本文内容
摘要
摘要
本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。
方案
在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养的人胚胎干细胞（hESCs）的传代
通常，根据特定的hESC细胞系，一个汇合的hESC培养板可以按1:6至1:10的比例进行传代。传代后的培养板将在传代后5至7天再次达到汇合状态。
- 分传前两天，使用0.1%明胶溶液对培养板进行明胶化处理。对于6孔板，每孔加入2 ml溶液，并将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育。2 组织培养箱中孵育过夜。
- 前一天将MEFs接种于明胶包被的6孔板中，以便计划传代hESCs时使用。（注意：如有需要，MEFs可提前最多3天接种。大约3天后，MEFs会变得更为扁平且铺展，维持hESCs的能力不如新鲜MEFs。）取一管经γ射线照射或丝裂霉素C处理的CF1 MEFs，细胞数量为5-6 × 10⁶。6 细胞从液氮中取出，在37°C水浴中解冻2分钟。用预热的MEF培养基在50 ml离心管中洗涤细胞一次，并将细胞重悬于最终体积的预热MEF培养基中。当细胞密度为5-6 x 106 细胞，足以接种两到三个6孔板。
- 在洗涤 MEFs 的同时，取出已明胶包被的培养板，吸净各孔中的溶液，每孔加入 2.5 ml MEF 培养基。
- 每孔加入 0.5 ml MEF 悬液，使每孔终体积为 3 ml。确保 MEF 均匀分散，将培养板放回培养箱中过夜，使细胞沉降。
- 在hESC传代当天，准备新鲜的或使用 < 2 周龄的无菌 IV 型胶原酶溶液，浓度为 1 mg/ml。吸除拟传代 hESC 孔中的全部培养基，每孔用 2 ml 温热的 1×PBS（pH 7.4）洗涤一次，然后每孔加入 1 ml IV 型胶原酶溶液。于 37°C 培养箱中孵育 5–10 分钟。将 6 孔板从培养箱中取出，每孔加入 1 ml 不含 bFGF 的 ES 培养基。用 1 ml 移液器吸取各孔中的液体，反复吹打，使干细胞从培养板上脱落。每孔约需吹打 5 至 10 次。随后，将悬浮的 hESC 转移至 50 ml Falcon 管中。对所有拟传代的孔重复上述操作，并将细胞悬液合并至同一个 50 ml Falcon 管中。于室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集 hESC 细胞沉淀，并用不含 bFGF 的 ES 培养基洗涤一次。
- 在洗涤 hESCs 的同时，取出 MEF 培养板，移除各孔中的全部培养基，并用无菌、预热的 1×PBS（pH 7.4）洗涤一次，然后每孔加入 2.5 ml ES 培养基（现添加 10 ng/ml bFGF）。
- 将沉淀的hESCs重悬于适量添加了10 ng/ml bFGF的ES培养基中。（注意：重悬后的hESCs应大致具有均匀的集落大小和形态。重悬体积取决于传代比例。）用移液器轻柔吹打hESC悬液数次，使集落变小且更加均一，但避免过度吹打导致产生单细胞或过小的集落。每孔加入0.5 ml hESC悬液至MEF培养板中，使每孔终体积为3 ml。加样后目视检查，确保hESCs分布均匀，然后将培养板放回培养箱中过夜沉降。接种后，集落通常需要数天时间才能呈现出其典型的形态和边缘特征。
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讨论
本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。在接种前的最后一步，当重悬hESCs时，细胞集落应大致具有均匀的大小和形态。轻轻吹打hESC悬液数次，以使集落变小且更加均一，但避免过度吹打导致产生单细胞或过小的集落。需要通过免疫荧光染色结合显微镜观察或流式细胞术检测hESC多能性标志物（如Oct-4和SSEA-4），以确认hESC在培养过程中维持未分化状态。
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致谢
Teitell 实验室的人类胚胎干细胞研究得到了加州再生医学研究所（CIRM）种子基金 RS1-00313 的资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）再生医学与干细胞研究 Broad 中心的成员，特别是 Amander Clark 博士、Jerome Zack 博士，以及 UCLA Broad 研究所干细胞核心设施的工作人员对本研究工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout血清替代物（KSR） | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11330-057 | |
| 非必需氨基酸 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | 试剂 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 35050-061 | |
| DMEM | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | 试剂 | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-谷氨酰胺 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25030-081 | |
| 生物医学工程 | 试剂 | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | 试剂 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 胶原酶IV | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | 试剂 | 干细胞技术 | 17105-041 | |
| 青霉素/链霉素 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15140-122 | |
| 明胶 | 试剂 | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | 试剂 | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 抗体 | 试剂 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| 抗人/鼠SSEA-4 藻红蛋白–rythrin 偶联小鼠 IgG3 | 试剂 | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC标记的抗兔IgG | 试剂 | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
参考文献
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
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