Method Article

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

DOI:

10.3791/831

⸱

June 9th, 2008

 ,  , 
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

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Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Abstract

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Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen, wie die Passage hESCs von MEF Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten zu wachsen.

Protocol

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hESC Kultur tägliche Wartung

  1. hESC Kulturmedien müssen alle 24 Stunden gewechselt werden. Von der ES Medien Vorratsflasche bei 4 ° C gelagert, nehmen Sie die Menge der Lösung benötigt werden (~ 20ml pro 6-well-Platte), in einem 50ml Falcon-Röhrchen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Nachdem die Medien wird erwärmt, fügen bFGF Lagerung bei 4 ° C bis zu einer Endkonzentration von 10ng/ml. Legen Sie die bFGF Aktie wieder bei 4 ° C sofort nach Gebrauch!
  2. Entfernen Sie aus dem 6-Well-Platten alle, aber ~ 500μl der Medien. Vergewissern Sie sich, wirbeln die Kulturschale zu Schutt zu entfernen auszusetzen. Sicherstellen, dass die bFGF in der hESC Kul....

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Discussion

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Dieses Video zeigt, wie die Passage hESCs von MEF Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten. Beachten Sie, dass die Kolonie Dichte auf Matrigel höher als die Dichte der Kolonien, die von üblichen Aufteilung auf MEFs ist. Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie oder Durchflusszytometrie für hESC Pluripotenz Marker, wie Oct-4 und SSEA-4, sind nötig, um Wartung von Zellkulturen in einem undifferenzierten Zustand in Feeder-freien Kulturbedingungen zu bestätigen.

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Acknowledgements

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Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden von einem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Mitglieder der Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, vor allem Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, und die Mitglieder des UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility für ihre Unterstützung unserer Studien.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Knockout Serum Replacer (KSR)ReagenzGIBCO, von Life Technologies10828-028
DMEM/F12ReagenzGIBCO, von Life Technologies11330-057
Reagenz von nicht-essentiellen AminosäurenGIBCO, von Life Technologies11140-050
GlutaMax ReagenzGIBCO, von Life Technologies35050-061
DMEMReagenzGIBCO, von Life Technologies11995-065
FBSReagenzClontech Laboratories631107
L-GlutaminReagenzGIBCO, von Life Technologies25030-081
BMEReagenzFisher ScientificBP176-100
bFGFReagenzR& D Systems233-FB-025
Kollagenase IVReagenzGIBCO, von Life Technologies17104-019
DispaseReagenzStammzell Technologies17105-041
Penicillin / Streptomycin ReagenzGIBCO, von Life Technologies15140-122
Gelatine-ReagenzChemicon InternationalES-006-B
MatrigelReagenzBD Biosciences354277
Oct-4 AntikörperReagenzSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc– Rythrin Konjugiertes Maus IgG3ReagenzR& D SystemsFAB1435P
FITCI-konjugiertes Antikaninchen-IgG-ReagenzJackson ImmunoResearch715-095-152

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.

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Human Embryonic Stem CellsMouse Embryonic FibroblastsMatrigel PlatingMedia Change ProtocolFGF SupplementationCollagenase TreatmentCell PassagingFeeder Free CultureConditioned Media PreparationStem Cell Splitting

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