Biology

सी एलिगेंस Dopamine न्यूरॉन अध: पतन परख की संभावित पार्किंसंस रोग जीन की मान्यता के लिए आवेदन

Published: July 18, 2008 doi: 10.3791/835

Laura A. Berkowitz¹, Shusei Hamamichi¹, Adam L. Knight¹, Adam J. Harrington¹, Guy A. Caldwell¹, Kim A. Caldwell¹

¹Department of Biological Sciences, University of Alabama

Summary

इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए पार्किंसंस रोग के लिए एक मॉडल के रूप में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन neurodegeneration आकलन. इसके अलावा, आनुवंशिक स्क्रीन कारक है कि या तो अध: पतन को बढ़ाने या neuroprotective हैं की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है.

Protocol

ए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड निर्माण

दो plasmids आवश्यक हैं: एक ऊतक विशेष हित के जीन की अभिव्यक्ति और चयन परिवर्तन मार्कर (हालांकि प्लाज्मिड मार्कर आमतौर पर अनुसंधान समुदाय के भीतर से उपलब्ध है) के रूप में एक दूसरे के लिए.

प्रायोगिक प्लाज्मिड

प्रमोटर है कि ब्याज के प्रकार / ऊतक कोशिका में व्यक्त किया है का चयन करें, इस मामले में, डीए (Pdat 1) ट्रांसपोर्टर प्रमोटर प्रयोग किया जाता है. प्लाज्मिड इस अभिव्यक्ति एक Invitrogen गेटवे प्रणाली संगत गंतव्य वेक्टर (pDEST - DAT-1) के रूप में बनाया गया ^था recombinational 1 क्लोनिंग द्वारा ब्याज प्रमोटर के बहाव के किसी भी जीन की प्रविष्टि की अनुमति.
हित के जीन की सीडीएनए है पीसीआर प्राइमरों कि गेटवे att बी recombinational अनुक्रम होते का उपयोग प्रवर्धित. प्रवर्धित सीडीएनए पहले दाता pDONR201 वेक्टर प्रविष्टि वेक्टर बनाने में recombined है और तब ई. कोलाई तनाव DH5α में तब्दील है. सफल recombinants और मिनी प्रस्तुत करने का डीएनए के अलगाव के चयन के बाद, प्रविष्टि वेक्टर pDEST - DAT-1 गंतव्य सदिश अभिव्यक्ति प्लाज्मिड बनाने में recombined है. Recombinational क्लोनिंग पर विवरण या तो Invitrogen गेटवे पुस्तिका से या काल्डवेल एट अल में उपलब्ध हैं ^5..

चयन प्लाज्मिड मार्कर

एक ट्रांसजेनिक प्लाज्मिड मार्कर एक स्पष्ट ऊतक में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइविंग प्रमोटर के साथ एक सदिश के होते हैं. इस विशेष प्रक्रिया में प्रमोटर unc 54 शरीर दीवार मांसपेशी में चेरी प्रोटीन अभिव्यक्ति (: चेरी Punc 54) ड्राइव.

Microinjection के माध्यम से ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस के बी जनरेशन

देखें: संबंधित जौव लेख http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

सी. जेनेटिक डीए neurodegeneration विश्लेषण के लिए पार

कीड़े मानक प्रक्रियाओं ⁶ का उपयोग कर बड़े हो रहे हैं.
प्लेस 10 Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP ^{1 नर,} 3-4 L4 मंच ट्रांसजेनिक hermaphrodites के साथ एक संभोग की थाली पर (व्यक्त Pdat - ^1: 2: जीन एक्स और Punc-54: चेरी ) . यह तीन अलग स्थिर बनाया लाइनों में से प्रत्येक के लिए व्यक्तिगत रूप से प्रदर्शन किया जाना चाहिए. दो दिनों के बाद, पुरुषों को हटा दें.
F1 पीढ़ी निरीक्षण, अगर वहाँ कई पुरुष संतान हैं, संभोग सफल रहा था.
प्रत्येक पार से 5 उभयलिंगी L4 जानवरों क्लोन कि एक्ज़िबिट दोनों Pdat-1: GFP फ्लोरोसेंट मार्कर (पुरुष माता पिता से विरासत में मिली) और Punc 54: चेरी फ्लोरोसेंट शरीर दीवार मांसपेशी मार्कर (द्विलिंग माता पिता से विरासत में मिला). क्लोन जानवरों L4 स्तर पर होना करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे अभी तक पुरुष थाली पर मौजूद जानवरों के साथ mated नहीं है की जरूरत है. उन्हें स्वयं को पार और F2 संतान का उत्पादन करने की अनुमति दें.
चरण 3 में उत्पादित F2 जानवरों बाहर क्लोन कर रहे हैं. विशेष रूप से, स्थानांतरण ~ 5-10 जानवरों है कि अपने स्वयं के व्यक्तिगत प्लेटों के लिए दोनों फ्लोरोसेंट मार्करों एक्ज़िबिट. स्क्रीन प्लेटें जहां डीए न्यूरॉन्स में पशुओं व्यक्त GFP और पशुओं के कुछ के 100% शरीर दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में व्यक्त चेरी के लिए F3 पीढ़ी. इन जानवरों को Pdat-1 के लिए homozygous जाएगा: α-syn; Pdat-1:: GFP जीन जबकि stably नव निर्मित transgene (जीन एक्स) प्रसारण.

डी. न्यूरॉन विश्लेषण डोपामिनर्जिक

तीन लाइनों के ऊपर बनाया के प्रत्येक के लिए एक ताजा थाली, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Pdat-1 तैयार: α-syn; Pdat-1: GFP अकेले तनाव. उन्हें वयस्कता करने के लिए विकसित करने की अनुमति दें.
प्रत्येक पंक्ति से एक ताजा थाली पर 30-40 ट्रांसजेनिक वयस्कों स्थानांतरण. उन्हें 20 º सी. पर 4 घंटे के लिए भ्रूण रखना करने के लिए अनुमति दें
वयस्कों निकालें. भ्रूण 20 º सी में 3-4 दिनों के लिए विकसित करने के लिए जब तक वे L4 मंच तक पहुँचने की अनुमति दें.
एक थाली में 0.04 मिलीग्राम / एमएल 5 fluoro 2'deoxyuridine (FUDR) युक्त ~ 100 ट्रांसजेनिक L4 जानवरों उठाओ. इस nucleotide डीएनए संश्लेषण के निषेध के माध्यम से अगली पीढ़ी के अनुरूप ब्लॉक विकास, इस प्रकार भारी प्रयोगात्मक ⁷ जानवरों से वंश को रोकने . प्रकाश से FUDR प्लेटों की रक्षा के बाद से यह प्रकाश के प्रति संवेदनशील है.
वयस्क पशुओं अंडे बिछाने के बाद विभिन्न दिनों पर विश्लेषण किया जाएगा. विश्लेषण के उचित दिनों empirically निर्धारित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, हम निर्धारित किया है कि 77%, 87%, और Pdat - 1 के 90%: α-syn; Pdat-1: GFP जानवरों 6 दिन, 7 और 10 पोस्ट विकास में degenerated डीए न्यूरॉन्स प्रदर्शन, क्रमशः. इसलिए, अगर हम अनुमान है कि ब्याज की transgene neurodegeneration बढ़ाने सकता है, हम 6 दिन और / या 7 पर विश्लेषण करेगा. इसी तरह, transgenes कि neurodegeneration दबाने हो सकता है 7 दिन और 10 पर विश्लेषण किया जाएगा.
4 ताजा agarose पैड (microinjection अगर पैड के विपरीत, इन ताजा उपयोग किया जाता है और अनुमति के बाहर सूखी नहीं). बाहर सेट दो खुर्दबीन स्लाइड है कि उन्हें भर टेप का एक टुकड़ा है, टेप equivalently मोटी पैड के लिए स्पेसर के रूप में कार्य करता है. एक तीसरे लेटाओबेंच पर उन दोनों के बीच स्लाइड (वे तीन बराबर में तैनात हैं). केंद्र स्लाइड पर पिघला हुआ agarose की एक बूंद प्लेस और जल्दी agarose के शीर्ष पर एक स्लाइड सीधा रखना करने के लिए और भर में सभी तीन स्लाइड्स. कई अतिरिक्त पैड बनाओ, दो स्लाइड्स साथ छोड़ने तक पैड इस्तेमाल के लिए तैयार है.
कीड़ा डीए न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए, एक 22 x 30 मिमी कांच कवर पर एक 3 मिमी levamisole (एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि) के 6 μl ड्रॉप जगह. 40 वयस्क पशुओं उठाओ (10 30 से परे अतिरिक्त रन हो) ड्रॉप में, तो agarose पैड पर कवर गिलास पलटना. अन्य लाइनों में से प्रत्येक के लिए दोहराएँ.
प्रत्येक सीईपी और ADE न्यूरॉन की उपस्थिति epifluorescence और एक फिल्टर क्यूब कि FITC या GFP के दृश्य की अनुमति देता है के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए प्रति पंक्ति 30 पशुओं कुल. हम उपयोग एक GFP HYQ फिल्टर क्यूब (Chroma प्रौद्योगिकी) प्रदान करना. संलग्न स्कोरिंग पत्रक पर डेटा रिकॉर्ड. जंगली प्रकार के पशुओं को पूरा GFP प्रतिदीप्ति सभी सीईपी में 4 और 2 ADE न्यूरॉन्स बनी रहेगी. व्यक्तिगत डीए न्यूरॉन्स की हानि प्रदर्शन जानवरों गैर WT या "degenerating" के रूप में रन बनाए हैं. इसी तरह, अध: पतन की हद कुल जनसंख्या के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रत्येक जानवर में खो न्यूरॉन्स की गिनती से रन बनाए जा सकता है.
विश्लेषण अधिक 2 बार (परीक्षण प्रति पंक्ति 30 प्रति अधिक पशुओं) दोहराएँ. विश्लेषण के तीन दौर से जंगली प्रकार न्यूरॉन्स डीए का प्रदर्शन के कीड़े की कुल संख्या का औसत है. Neuroprotection के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण तो छात्र टी परीक्षण (पी <0.05) का उपयोग करने के लिए नियंत्रण कीड़े (: α syn; Pdat-1: Pdat-1: GFP) की तुलना उपभेदों के साथ किया जाता है कि खत्म डीए न्यूरॉन्स में व्यक्त उम्मीदवार जीन .

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Discussion

dopamine न्यूरॉन्स की उम्र पर निर्भर हानि पार्किंसंस रोग के नैदानिक पहचान है और है या एक प्रोटीन अल्फा synuclein कहा जाता है के संचय misfolding के साथ संबद्ध किया गया है है. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे लेबल करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट transgene के माध्यम से, सी. के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स एलिगेंस और coexpressing अल्फा synuclein मानव द्वारा पार्किंसंस रोग में इन कोशिकाओं में देखा neurodegeneration नकल.

यह वीडियो विकास, आनुवंशिक पार, बढ़ते, और ट्रांसजेनिक नेमाटोड के स्कोरिंग के लिए आनुवांशिक कारक है कि या तो neurodegeneration बढ़ाने के लिए या उम्र बढ़ने के पाठ्यक्रम पर neuroprotection प्रदान का मूल्यांकन पद्धति दर्शाया गया है. केयर transgene रखरखाव के लिए मार्कर का उपयोग उचित पुरुष और सफल आनुवंशिक पार सुनिश्चित करने के लिए hermaphrodites का मंचन किया, और न्यूरॉन हानि या सुरक्षा स्कोरिंग में स्थिरता के लिए लिया जाता है. इस तरीके में, सी. एलिगेंस आनुवांशिक कारक है कि या तो neurodegeneration के लिए योगदान कर सकते हैं या बढ़ाने के न्यूरॉन अस्तित्व के लिए चिकित्सकीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व के तेजी से मूल्यांकन की सुविधा .

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Acknowledgments

हम सभी काल्डवेल लैब के सदस्यों के सहकारी भावना को स्वीकार चाहते हैं. आंदोलन विकारों अनुसंधान प्रयोगशाला में dystonia Bachmann - स्ट्रॉस और पार्किंसंस फाउंडेशन, संयुक्त पार्किंसंस फाउंडेशन, अमेरिकी पार्किंसंस रोग एसोसिएशन, अलबामा के पार्किंसंस रोग एसोसिएशन, माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन पार्किंसंस अनुसंधान के लिए, और एक अंडर ग्रेजुएट रिसर्च द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Microscope Slides	Plain, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Dissecting with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645
Epifluorescent	Microscope	Nikon Instruments	Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.

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References

Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).