Summary
자유롭게 동물을 이동 고유 뇌 세포 지역에서 신경 전달 물질 수준의 모니터링 신경 전달 물질 방출과 행동 사이의 링크에 통찰력을 제공합니다. 그리고 기초 neurotransmission가 약리 또는 생리적 조작에 의해 변경하는 방법에 대한 정보, 전기 탐지와 결합하여 생체내 microdialysis 우수한 해부 학적 및 화학적 해상도를 제공합니다.
Abstract
깨어있는 동물의 두뇌에있는 신경 전달 물질의 세포 기저 수준을 측정하는 능력은 CNS 다른 체계 문제점 (약리 또는 생리학)의 효과의 결정을 허용합니다. 예를 들어, 하나는 직접 동물의 midbrain의 도파민 추정치는 음식과 같은 D - 암페타민 또는 자연 자극과 같은 도파민 - 공개 의약품에 대응 방법을 측정할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 삽입과 임플란트 microdialysis 프로브를과 세포 수준을 측정하는 전기 감지 (HPLC - EC)와 결합하여 고성능 액체 크로마 토그래피를 사용하는 방법하는 방법 쥐의 두뇌의 특정 사이트를 대상으로 가이드 cannulas을 이식하는 방법을 보여 oxidizable 신경 전달 물질과 metabolites. microdialysis 프로브를 통해 약물의 정확한 지역 소개 행동 화합물의 메커니즘에 사이트 특이성에서 정제 작업을 허용합니다. 이 기술은 탁월한 해부학 화학 해상도를 가지고 있지만 microdialysis 샘플로만 겸손한 시간 해상도는 일반적으로 감지 신경 전달 물질의 수준을 보장하기 위해 모든 20-30분을 처리됩니다. 보완 예 생체내 도구 (즉, 조각과 세포 문화 전기 생리학) 실시간 neurotransmission을 모니터링과 함께 도움을 줄 수 있습니다.
Protocol
개요
과 xylazine (10 MG, 2 개월 된 평균 연령 C57BL/6J 마우스 또는 이와 동등한 또는 3 개월 이전의 평균 연령 스프 라그 돌리 쥐 또는 이에 상응하는 마취제 (쥐 100 MG / kg IP 쥐 60 MG / kg IP)로 anesthetized 아르 / kg, 수종 중의 IP). 진정 작용은 반사가 시연 철회 부드러운 발가락 핀치를 사용하여 모니터링할 수 있습니다 . Walantus 외 (조브, 6, 2007)와 Szot 외. (조브, 9, 2007). Thermoregulation은 thermostatregulated 손난로 (에이러 인 스트 루먼트 주식 회사)를 통해 제공하고 직장 온도계를 통해 모니터링할 수 있습니다. 머리는 모피의 면도와 절개 전에 요오드와 함께 청소합니다. 피부 절개 (마우스에 대한 1cm 길이 쥐에 대한 2cm 길이)와 두개골의 표면에서 부드러운 조직을 제거 후, 가이드 정맥의 게재는 bregma과 관련하여 결정됩니다. 6mm 구멍은 설치류 수술을위한 배터리로 작동하는 드릴러 (파인 과학 도구, 주식 회사)와 두개골을 통해 뚫고있다. 케어는 드릴 비트가 meningeal 세포막이나 혈관을 통해 침투하지 않도록 촬영입니다. 두개골 뒷부분의 핵 accumbens, striatum 지느러미 또는 전두엽 피질에 이르는 양국 5mm 21 게이지 스테인레스 스틸 가이드 샤프트와 함께 심어입니다. stereotaxic 좌표 프랭클린과 Paxinos 1997 년 당 설립 (Stereotaxic 좌표에서 마우스의 뇌, 아카데믹 프레스) 또는 Paxinos와 왓슨 일 (Stereotaxic 좌표, 학술 잡지에서 랫 브레인). 아르 임플란트는 치과 시멘트에 의해 보안됩니다. 0.9 %의 염분의 Lactated 링거스의 볼러스은 탈수를 방지하기 위해 수술의 끝 (쥐에 5mls SC와 생쥐 1 ML SC 유체가 정상 체온으로 따뜻하게 후)에 주어집니다. 동물이 고통하는 것으로 판단되는 경우 Buprenorphine (0.1-0.5mg/kg SC)는로서의 필요한 기준으로, 다음 회 실시하고 있습니다. 게시물 수술 감염이 발생하면 항생제 치료 지역 (bacitracin 연고)과 체계적 항생 치료 (페니실린 100,000은 처음 48 시간 이후 찍기 위해 12 시간마다 IM IU / kg)을 관리하고 있습니다.
수술 후, 동물은 개별적으로 음식과 물을 사용 가능한 광고 libitum와 함께 지내게됩니다. 적어도 한 주에 microdialysis와 안락사 전에 복구를 위해 허용됩니다. 수술에서 회복 후, 동물은 microdialysis 케이지 및 microdialysis 프로브 수술 중에 설치된 가이드 샤프트에 삽입하고 초경 아르으로 전송됩니다. 탐사선이 가이드 샤프트를 통해 피부, 근육 및 meningeal 조직을 우회하기 때문에 프로브 삽입 통증이나 불편함의 원인이되지 않습니다. 따라서, 프로브 삽입은 마취없이 수행하고 있으며 신경 화학이나 행동에 어떤 마취 유도 효과는 피할 수 있습니다. 우리는 실험에 따라 다른 8-12시간 위해 30 분마다 샘플링 시작 후 프로브는 12 시간 동안 안정이 우선합니다. 우리는 photocells 또는 실험자에 의해 운동의 수동 녹화를 통해 동물의 전위의 동작을 모니터링합니다. Microdialysate 샘플은 전기 감지 (HPLC - EC) neurochemical 감지 및 분석을위한 계기로 고성능 액체 크로마 토그래피에 주입하고 있습니다. 우리는 신경 화학 기초 및 운동력이있는 사람의 행동에 대한 효과를 찾습니다. 실험의 끝에 동물은 체계 케타민 (200 MG / kg IP)와 xylazine (20 MG / kg, IP)의 과다 복용에 의해 euthanized있다. 그러면 심장은 4 % paraformaldehyde 다음 0.9 %의 식염수에 perfused 있습니다. 두뇌는 제거 냉동 정확한 프로브 위치를 확인 microdialysis 프로브 트랙트 따라 절단됩니다.
절차
- stereotaxic 악기 및 필요한 모든 자료를 설정합니다. 지역과 악기는 세척 및 소독 있는지 확인합니다.
- 전기 면도기와 모피를 면도. 그냥 눈에 사이에 귀를에서 이동 효과적으로 모피의 영역을 청소 다른 방향으로 면도기를 이동합니다. 면도 지역 povidine / 요오드를 적용하지만으로부터 눈을 보호합니다.
- 귀에 운하에 귀 막대를 삽입하고 제자리에 강화하여 stereotaxic기구에 동물을 탑재합니다. 다음 첫 포가 1 귀 귀 운하의 바, 및 장소와 다른 귀에 표시줄에 슬라이드에 고정. 당신은 머리가 더 이상 측면쪽으로 이동 수 없습니다 때 당신은 올바른 위치에 알고있다. stereotaxic의 앞쪽에 장착으로 입을 보호하고 머리가 통치자와 수준되었는지 확인합니다. stereotaxic 악기 플랫폼에 대하여 수직 위치에서 눈금자를 넣고) 동물의 두피의 통치자와 중간 사이에 90 ° 각도 확인하십시오. 이 같은 기능을 제공하는 경우 stereotaxic 악기를 통해이 작업을 확인합니다.
- 람다에서 불과 동물의 눈 사이에에 연장 멸균 메스로 두피에 앞쪽에 / 사후 절개를합니다. 피부를 꼬집어와 절개를 열어 유지 살균 hemostats를 사용합니다. 여러 멸균 솜 면봉을 사용하여 노출된 두개골 표면을 건조.
- 이 위치를 통해 가이드 정맥 오른쪽 두개골에 bregma하고, 위치를 찾아 자사의 탑재로 안내 정맥 놔. 후부 / 앞쪽에 및 측면 좌표를 적어 두십시오. bregma에서 stereotaxic 아틀라스의 도움으로 프로브의 위치에 필요한 정확한 좌표를 찾으십시오. 추가 또는 bregma 값에서 빼는 방법으로 올바른 좌표에 대한 안내 정맥을 놓습니다. 그것이 복부 좌표를 기록 후 두개골을 감동, 그리고 때까지 가이드 정맥을 가져와. 두개골이 위치에 살균 연필로 연필 자국을 만들어, 이것은 당신을 드릴 것입니다 곳입니다.
- 가이드 정맥을 제거하고 드릴 비트를 검사. 당신은 두개골의 넓이를 얻을 때까지 조심스럽게 연필 마크에 구멍을 드릴. 그것이 측면을 건드리지 않고 구멍을 지우면 볼 수있는 가이드를 정맥에 문의하십시오. 정맥은 직선 경로에 지울 수 있습니다까지 드릴링 및 점검 유지. 구멍이 만들어되면 부드럽게 정맥의 가리지 삽입을 허용하기 위해 meninges을 주먹으로 멸균 바늘을 사용합니다.
- 정맥 구멍, 그리고 양쪽에 후부 두 측면 정맥 구멍, 2-2 앞쪽에 : 다음 핸드 드릴을 사용하여 두개골 나사 6 구멍을합니다. 여섯 개의 나사를 소독하고 그들이 단단하게에 정박하기 전까지는 머리에 그들을 놓으십시오.
- 에탄올과 생리, 마운트와 가이드의 정맥을 청소하고, 적절한 복부 좌표로 천천히 낮춥니다. 측면이 감동하지 않으며 그것이 완벽하게 수직으로 될 것이 있는지 확인합니다.
- medially 및 사후 두개골 나사 뒤에 앵커 나사를 놓고 핀셋와 함께 제자리에 고정. 액체 치과 시멘트의 얇은 배치를 섞어 가이드 정맥, 나사 및 살균 주걱으로 두개골의 나머지 부분을 커버. 또 다른 배치, 두꺼운 이번에는 완전히 지역과 그것을 확보하기 위해 충분한 정맥과 앵커 나사를 커버합니다.
- 시멘트가 두껍게되고 그것이 굳은 전에 시멘트 뚜껑은 모든 주위 부드러운되고 나중에 피부를 자극하지 않도록 주걱으로 시멘트 잔을 시멘트 컵에서 피부를 분리하고 금형.로서
- 치과 시멘트가 완전히 장치에서 동물을 제거하기 전에 건조하실 수 있습니다. hemostats를 제거합니다. bacitracin에게 시멘트 뚜껑 주위에있는 모든 방법을 적용합니다.
- 일단 동물이 stereotaxic 악기 해제되어, 생리 SC (subcutaneously) 1 ML 다음 페니실린 IM (내부 근육)의 0.25 ML로 주사.
- 자체 새장에 동물을 놓고 그것이 회복하기 위해 방을로 돌아가기 전에 의식이 될 때까지 그것을 모니터합니다.
- 그들은 수술과 수술 매일 당일 마취에서 회복까지 감염과 고통 / 고민 평가의 흔적을 위해, 실험이 끝날 때까지, 동물을 모니터링합니다. 이것은 주말 및 공휴일이 포함되어 있습니다. 낮은 자발적인 운동, 처리시 조난 발성, hunched 자세, 설사, 팽창과 headmount 면적, 그리고 수유 / 마시 부족의 방전은 고통과 고민의 흔적입니다. 동물이 고통하는 것으로 판단되는 경우 Buprenorphine은 (0.1-0.5mg/kg SC), 등 - 필요한 기준으로 다음, 매일 두 번 실시하고 있습니다. 게시물 수술 감염이 발생하면 항생제 치료 지역 (bacitracin 연고)과 체계적 항생 치료 (페니실린 100,000은 처음 48 시간 이후 찍기 위해 12 시간마다 IM IU / kg)을 관리하고 있습니다. 이러한 현상 중 하나가 buprenorphine의 관리, 보충 유체, 그리고 수술 12 시간 이내에 항생제 치료를 다음과 계속하면, 동물은 euthanized이다.
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Discussion
생체내의 microdialysis에서 살아있는 동물의 독특한 두뇌 사이트에 여러 신경 전달 물질과 metabolites 측정을위한 최고의 도구입니다. 그러나, 그것은 오직 neurochemicals의 세포 수준을 모니터링하고 실시간으로 신경 전달 물질의 exocytosis를 모니터링하는 시간 해상도를 제공하지 않습니다. "NET - 플럭스 '라는 기술의 버전을 통해, 해당 사이트의 실제 신경 전달 물질의 농도가 차례로 플라즈마 막 전송기를 통해 reuptake의 신경 전달 물질 비율의 정확한 측정을 줄 수있는, 계산하실 수 있습니다.
Microdialysis는 동물의 다른 그룹 (예 : 다른 genotypes) 사이에 신경 전달 물질 방출에 대한 약물이나 다른 조작의 효과를 파악에 기초 세포 신경 전달 물질 수준의 차이를 설명에 이상적입니다.
형광 검출과 함께 모세관 구역 전기 영동 (CZE)와 같은 HPLC - EC으로 대체 assays의 도입은 샘플 당 몇 분 이내에 생체내의 microdialysis에의 시간 해상도를 증가하고 있습니다.
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Acknowledgments
DK065872 (ENP), 바이오 메디컬 연구에 우수의 스미스 가족 재단 수상 (ENP), F31 DA023760 지원.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
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