Summary
המודל עכברוש הלידה לפגיעה hypoxic-איסכמי המוח הוא מודל ומבוססת של אנצפלופתיה הילוד האנושי איסכמי היפוקסי (HIE). במאמר זה, אנו מתארים את המודל של HIE ב שלאחר הלידה גורי חולדה.
Abstract
Hypoxic-איסכמי אנצפלופתיה (HIE) הוא תוצאה של חנק מערכתית המתרחשים בלידה. עשרים וחמישה אחוזים של יילודים עם HIE לפתח sequelae neuropsychological חמור וקבוע, כולל פיגור שכלי, שיתוק מוחין ואפילפסיה. התוצאות הן הרסניות של HIE וקבוע, מה שהופך אותו קריטי לזהות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כדי להפחית פגיעה מוחית בתינוקות עם HIE. לשם כך, המודל עכברוש בילוד לפגיעה hypoxic-איסכמי במוח פותחה מודל זה המצב האנושי. המודל HIE היה תוקף לראשונה על ידי ואנוצ'י ואח' 1 ומאז נעשה שימוש נרחב כדי לזהות את המנגנונים של פגיעה מוחית כתוצאה הלידה היפוקסיה איסכמיה-2 ו לבדוק התערבויות טיפוליות פוטנציאל 3,4. המודל HIE הוא תהליך דו שלב כרוך קשירת של עורק התרדמה השמאלי משותף ואחריו חשיפה לסביבה hypoxic. זרימת הדם במוח (CBF) בחצי הכדור ipsilateral על עורק הצוואר ligated אינו פוחת בגלל זרימת דם בטחונות דרך המעגל של ויליס, אולם עם מתח חמצן נמוך, CBF בחצי הכדור ipsilateral מקטין באופן משמעותי ותוצאות פגיעה איסכמי חד צדדית . השימוש כלוריד-2,3,5 triphenyltetrazolium (TTC) להכתים ולזהות רקמת מוח איסכמי פותחה במקור עבור דגמים הבוגרת של איסכמיה מכרסם מוחין 5, והוא משמש כדי להעריך את מידת infarctin מוחין בנקודות זמן מוקדם של עד 72 שעות לאחר האירוע איסכמי 6. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את המודל hypoxic-איסכמי פגיעה במוח חולדה הלידה ואת הערכה של גודל האוטם באמצעות מכתים TTC.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת סטנפורד פועלת לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות מעבדה.
עכברוש ילודים HIE מודל
- יום הודעה הלידה (PND) 7 Sprague-Dawley גורי חולדה (Charles River Laboratories, Inc, בווילמינגטון, MA) מורדמים באופן מלא עם isoflurane (Aerrane, בקסטר, Deerfield, IL;% 3-4 לזירוז ו 1-2% עבור תחזוקה).
- חתך קטן עשה בצוואר (Extra Thin איריס מספריים # 14088-10, פיין למדע כלי Inc, פוסטר סיטי, קליפורניה) כדי לחשוף את עורק התרדמה השמאלי משותף (CCA).
- המרכז לאמנות עכשווית הוא ligated עם תפר 5-0 משי (5-0 משי, Ethicon, סומר, NJ).
- החתך נסגר עם דבק cyanoacrylate (Elmers מוצרים Inc, קולומבוס, OH). החתך מכוסה קלטת הרדמה היא נעצרה. הגורים הם חזרו אל הסכר שלהם מותר להתאושש במשך 1-2 שעות.
- גורים ממוקמות אז בתא hypoxic המכיל חמצן 8% מאוזנת עם חנקן 92% עבור 100 דקות 37 ° C. 8 oxygen/92%% גז חנקן (Airgas, סקרמנטו, קליפורניה) זרימה דרך צינור לתוך הכלוב העכבר מצויד בכיסוי פלסטיק. הכיסוי עשוי להתאים לכלוב ויש לו שני חורים של 2 ס"מ קוטר, אחד מהם לקבל את הצינור המחובר הטנק 8% חמצן גז אחר מאפשר הגז flowout. החדר ממוקם בתוך אמבט מים הוא התחמם לפני השימוש מדחום בתוכו חייב לרשום 37 ° C לפני תחילת היפוקסיה.
- בתום 100 דקות של היפוקסיה, הגורים הם חזרו שוב אל סכר שלהם להחלמה.
- 24 שעות לאחר סיומה של היפוקסיה, הגורים מומתים על ידי הרדמה עמוקה עם isoflurane. רקמת המוח היא perfused עם מלח רגיל קר, ואחריו פתרון של TTC 1% קר פוספט pH שנאגרו מלוחים, 7.4 (Sigma כימית Co, סנט לואיס, מיזורי). TTC חייב להישמר מפני אור.
- המוח יוסרו מקורר למשך 1-2 דקות על קרח, לארבעה חלקים העטרה 3 מ"מ זה מזה (רמות 1-4) נחתכים, החל rostrally ברמה של opticchiasm ו משפך, המתאים גבחת 1.8 ~ 2.0 מ"מ רמת המוח עכבר מבוגר.
- פרוסות המוח שקועים פתרון TTC וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, ואחריו קיבעון paraformaldehyde 4% / PBS לילה. מכיוון TTC אור רגישים, לשמור על פרוסות מן האור בתקופה זו.
- סעיפים מוכתם TTC נסרקים ו דיגיטציה. באמצעות תמונה J (NIH, Bethesda, MD), את הדברים הבאים נמדדים עבור כל רמה: אזור של אוטם (אזור בלא כתם), שטח של חצי הכדור ipsilateral, ועל שטח של חצי הכדור הנגדי. אחוז infarcted שטח לכל פרוסה מחושב: (באזור של האוטם / שטח של חצי הכדור ipsilateral) או 1, 2, 3, 4. נפח אחוז האוטם מחושב כסכום (1 + 2 + 3 + 4) * 3mm. תחומי פגיעה בקליפת המוח או striatal ניתן לכמת בנפרד באופן דומה.
נציג תוצאות
באיור 1. נציג HIE העטרה רמות 1-4 מוכתם TTC.
סעיפים TTC העטרה מוכתם להפגין שטח של האוטם (בלבן).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל הלידה מכרסם HIE הוא מודל נקבע כי משחזר היפוקסיה מוחית המתרחשים בתקופה פרי הלידה של ילודים. מחקרים נרחבים אפיון היסטולוגית ו immunocytochemical הראו כי מכרסמים בן 7 היום יש את הבגרות המוח מקביל מודל בשליש השלישי העובר האנושי 7. המודל HIE מכרסם כבר אינפורמטיבי מאוד להבנת המנגנונים של פגיעה מוחית מ היפוקסיה פרי הלידה 2, שם התערבויות כגון היפותרמיה אומתו 3. מודל זה שלמות תחילה חולדות מותאם ולאחרונה לעכברים 8.
יש פרטים טכניים ספציפיים צו להזכיר:
- לפני קשירת של המרכז לאמנות עכשווית, הקפד להסיר את רקמת החיבור ואת nervus התועה שעלול לסבך המרכז לאמנות עכשווית. עם קשירת מוצלח של המרכז לאמנות עכשווית, צבע כלי מעל האתר קשירת צריך להלבין. לחילופין, מומלץ גם להכפיל ולקשור לחתוך באמצע אתר two קשירת. כסה את החתך מעל המרכז לאמנות עכשווית ligated עם הקלטת התווית לפני הצבת האחורי הגור עם סכר שלה.
- משך הזמן המרבי של לא יותר מ 10 דקות של הרדמה עבור כל גור הוא אופטימלי עבור קשירת המרכז לאמנות עכשווית ואת התוצאה המוצלחת.
- תקופת החלמה לאחר קשירת המרכז לאמנות עכשווית צריכה להיות 90-120 דקות. אם קצר, גורים נוטים פחות לשרוד, ואם כבר יהיו שונות יותר של אוטם, הנוטה לכיוון אוטמים קטנים.
- טמפרטורה היא קריטית. תמיד מקום מדחום בחדר ולשמור את הטמפרטורה ב 37 ° C. אורכו של היפוקסיה עשויים להשתנות 90-120 דקות, בהתאם למצב ועל חומרת הפגיעה אתה רוצה להשיג.
- מכתים TTC ישים לניתוח נפח האוטם עד 72 שעות לאחר HIE. זמן ארוך יותר נקודות הישרדות צריך להיות מוערך על ידי חתך והכתים סגול cresyl כדי לקבוע את גודל האוטם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
הממומן על ידי איגוד הלב האמריקני ואת מצעד הפרוטות.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
- Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats. Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).
- Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury. Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).
- Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat. Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).
- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
- Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).
