Ağaçlardaki her sonbahar yapraklarının neden yeşilden sarı, turuncu ve kırmızı tonlarına dönüştüğünü hiç merak ettiniz mi? Yapraklara ilk etapta parlak renklerini veren nedir? Cevap, güneş ışığında belirli dalga boylarını emen ve diğerlerini yansıtan pigmentler içeren kloroplast adı verilen bitki organellerinde yatmaktadır. Belirli bir pigment olan klorofil, yaz aylarında en bol bulunan pigmenttir. Güneş ışığından gelen yüksek enerjili, mor, mavi ve kırmızı dalga boylarını emer ve yapraklara yeşil görünüm veren yeşil dalga boylarını yansıtır. Yapraklarda kırmızı ve sarı ışığı yansıtan karotenoidler gibi başka pigmentler de vardır. Sonbaharda yapraklar pigmentlerini yenilemeyi bırakır. Klorofil diğer pigmentlerden daha hızlı bozulduğundan, bu karotenoidlerin renkleri maskelenmez.
Yeşil bir yaprakta farklı pigmentlerin varlığı, molekülleri belirli bir çözücü içindeki çözünürlüklerine göre ayıran hidrofilik bir polimer olan kromatografi kağıdı ile gösterilebilir. İlk olarak, yaprak özü kağıda yüklenir. Kağıt organik bir hidrofobik çözücüye daldırıldığında, çözücü kılcal hareket nedeniyle kağıt boyunca hareket eder ve yol boyunca yaprak ekstraktındaki farklı pigmentleri ayırır. En hidrofobik olan pigmentler kağıdın daha yukarısına taşınır. Hidrofilik pigmentler ise selüloza bağlanır ve bu da hareketlerini engeller. Tüm pigmentler hidrofobikliklerine göre sıralandıktan sonra, tutma faktörünü veya Rf değerlerini hesaplayabiliriz. Rf değeri, bir pigmentin kat ettiği mesafenin, çözücünün kat ettiği mesafeye oranıdır. Her pigmentin benzersiz bir Rf değeri vardır ve hesaplanan değerleri standartlarla karşılaştırarak pigmentleri kolayca tanımlayabiliriz. Bitkilerin karbondioksit, su ve ışık enerjisini kimyasal enerji ve oksijene dönüştürdüğü süreç olan fotosentez, öncelikle bir bitkinin yapraklarında gerçekleştirilir ve klorofil bu süreçte kritik bir rol oynar. Kloroplastlar, her biri belirli bir görevi yerine getiren ve karmaşık şekillerde etkileşime giren düzinelerce klorofil molekülü içerir. Sonuç olarak, ışık enerjisi, klorofil moleküllerinin diğer metabolik süreçlerde kullanılan elektronları bırakmasına neden olur. Bu nedenle, klorofil kaybettiklerini yerine koymak için sürekli bir elektron kaynağına ihtiyaç duyar. Bu yedek elektronlar, su moleküllerinin protonlara, elektronlara ve oksijen moleküllerine bölünmesinden gelir. Yüksek fotosentez oranlarında, elektronları yenilemek için su daha hızlı bölünür ve oksijen hızla üretilir.
Bu fenomen, bikarbonatın zengin bir karbon kaynağı olarak işlev gördüğü bir bikarbonat çözeltisinde yaprak diskleri basitçe askıya alarak laboratuvarda fotosentez oranını değerlendirmemize yardımcı olur. Yaprak disk deneyinin başlangıcında, bir şırınga içinde vakumla negatif basınç uygulanarak gazlar yaprak disklerinden dışarı atılır. Gazları dışarı atılan yaprak diskler ağırlaşır ve bir behere aktarıldığında bikarbonat çözeltisinin dibine batar. Fotosentez gerçekleştiğinde, klorofil elektronlarını yenilemek için ortamdaki su bölünür. Ortaya çıkan oksijen, diskleri daha hafif hale getirir ve zamanla yüzeye çıkmalarına neden olur. Daha yüksek fotosentez oranlarına izin veren ortamlar, daha hızlı yüzen disklere sahiptir.
Bu laboratuvarda ilk olarak kromatografi kağıdı kullanarak ıspanak yapraklarındaki pigmentleri ayıracak ve tanımlayacaksınız. Daha sonra bir yaprak disk deneyi ile sudaki ve bikarbonat çözeltisindeki fotosentez oranını değerlendireceksiniz.
Bitki Pigment Kromatografisi
ul class="lab-items">
NOT: Bu deneyde kromatografi kağıdı kullanarak ıspanak yapraklarından pigmentleri ayıracaksınız. Bireysel pigmentler kağıt boyunca farklı oranlarda hareket eder ve farklı renklere sahip olabilir. Pigmentlerin kat ettiği bağıl mesafeyi, çözünürlük faktörlerini hesaplayarak ve bunları literatür değerleriyle karşılaştırarak farklı pigmentleri tanımlayabilirsiniz. HİPOTEZLER: Bu alıştırmada deneysel hipotez, ıspanak yaprakları içinde güneş ışığının farklı dalga boylarını emen birden fazla pigment olacağıdır. Sıfır hipotezi, ıspanak yaprağının içinde yalnızca bir tür pigment olduğudur.
Kromatografi kağıdının bir ucundan iki santimetrelik bir çizgi oluşturmak için bir kalem kullanın.
Ardından, 400 mL'lik temiz bir beherin üstüne yatay olarak bir boru temizleyici yerleştirin.
Kromatografi şeridinin kalemle işaretlenmiş tarafını beherin altına yerleştirin.
Ardından, kağıdı boru temizleyicinin etrafına, alt kenarı beherin altına zar zor değecek şekilde sarın ve ardından bir ataşla sabitleyin.
Kağıt boru temizleyicinin etrafına sabitlendiğinde, beherden çıkarın ve ardından kromatografi kağıdı üzerindeki işaretli çizginin üzerine okşayarak kuru bir ıspanak yaprağı yerleştirin.
Kalem çizgisi boyunca ıspanak yaprağının üzerine bir bozuk para yuvarlayın, birkaç kez ileri geri gidin ve sabit basınç uygulayın. Yaprak çıkarıldığında, yeşil bir çizgi açıkça mevcut olmalıdır.
Ardından, behere 8 mL kromatografi çözücüsü yerleştirin.
Kromatografi şeridini, kağıdın kenarı çözücüye değecek ancak yeşil çizgi değmeyecek şekilde behere indirin. Gerekirse boru temizleyiciyi ayarlayın.
Beheri rahatsız etmeden, çözücüyü kağıtta yukarı doğru hareket ederken ve tek tek pigmentler ayrılırken gözlemleyin.
Çözücü, kromatografi kağıdının yarısına kadar ilerlediğinde, bu yaklaşık 10 dakika sürecektir ve pigmentler iyi tanımlanmış bantlara ayrıldığında, kağıdı beherden çıkarın.
Çözücünün ne kadar ilerlediğini bir kalemle işaretleyin ve ardından kağıdın kurumasını bekleyin. NOT: Çözücü hızla buharlaşır.
Ardından, görünür bantların sayısını kaydedin ve renklerini ve göreceli boyutlarını tanımlayın.
Kromatografi çözücüsünü çeker ocak altındaki bir atık kabına atın. Kromatografi şeritlerini normal çöp kutusuna atın ve ardından beherleri sabun ve suyla temizleyin.
Vakumda Yüzen Yaprak Diskler
ul class="lab-items">
NOT: Bu deneyde, bir çözelti içinde yüzen bir yaprak diski kullanarak fotosentez ve hücresel solunumu dolaylı olarak gözlemleyeceksiniz. Fotosentez sırasında hava kabarcıkları yaprakların yüzmesine neden olur ve solunum sırasında diskler batar. HİPOTEZLER: Bu alıştırmada, deneysel hipotez, yaprak disklerinin bikarbonat çözeltisinde daha yüksek bir fotosentez hızına sahip olacağıdır, çünkü bikarbonat, fotosentezi beslemek için ilave CO2 sağlayarak daha fazla yaprak diskinin yüzmesine neden olur. Ek olarak, tüm diskler hücresel solunum gerçekleştirirken karanlık koşullarda batacaktır. Sıfır hipotezi, fotosentez hızında ve dolayısıyla bikarbonat ve su veya açık ve koyu tedaviler arasında yüzen disklerin sayısında hiçbir fark olmayacağıdır.
Yaprak diskleri vakum altına yerleştirmek için önce pistonları iki adet 20 mL'lik şırıngadan çıkarın ve ardından her bir şırınga tüpünün içine 10 yaprak disk yerleştirin. Bir şırıngayı "bikarbonat" olarak etiketleyin ve diğer şırıngayı "su" olarak etiketleyin.
Pistonları değiştirin ve şırıngada çok az miktarda hava kalana kadar pistonu itin. Yaprak disklere zarar vermemeye dikkat edin.
Bikarbonat çözeltisinin 5 mL'sini şırıngalardan birine çekin. Yaprak diskleri çözelti içinde askıya almak için şırıngayı ters çevirin ve döndürün.
Çözeltiyi dışarı atmadan veya yaprak disklere zarar vermeden mümkün olduğunca fazla havayı dışarı itin.
Ardından 5 mL su solüsyonunu diğer şırıngaya çekin ve daha önce açıklandığı gibi döndürün (adım 3).
Vakum oluşturmak için, pistonu geri çekerken bir parmağınızı şırınganın ucunun üzerinde tutun. Yaprak diskleri askıda tutmak için şırıngayı döndürürken bunu 10 saniye basılı tutun.
Ardından, vakumu serbest bırakın. NOT: Diskler, solüsyonu dokularındaki hava boşluklarına emmiş olmalı ve battıklarını görmelisiniz. Diskler batmazsa, vakum oluşturma işlemini üç defaya kadar tekrarlayabilirsiniz.
Ardından, plastik bir bardağa veya cam behere 50 mL bikarbonat çözeltisi ekleyin ve ardından diskleri bikarbonat vakum şırıngasından yavaşça ekleyin.
Kontrol için, aynı miktarda suyu aynı bardağa ekleyin ve ardından yaprak diskleri su vakum şırıngasından ekleyin. Kapları uygun şekilde etiketleyin.
Her iki bardağı da bir ışık kaynağının altına yerleştirin.
Ardından, kapları ışık kaynağından çıkarın ve ardından yüzeydeki disklerin yüzeydeki herhangi bir gazla karışması için döndürün.
Bardakları karanlık bir yere taşıyın. Her beş dakikada bir, 20 dakika geçene kadar yüzeyde yüzen yaprak disklerin sayısını kaydedin. Bardağı tekrar karanlığa koymadan önce her seferinde döndürün.
Temizlemek için yaprak diskleri çöp kutusuna atın ve bikarbonat solüsyonunu kanalizasyona dökün. Şırıngaları ve bardakları iyice yıkayın.
Results
ul class="lab-items">
NOT: İlk deneyde, ıspanak yapraklarından gelen pigmentlerin kromatografi kağıdı üzerinde ne kadar uzağa gittiğini gözlemlediniz. Farklı pigmentler, farklı dalga boylarında ışığı emer.
Renkli kalemler veya kurşun kalemler kullanarak, pigment bantlarının ve çözücünün konumlarını Şekil 3'te çizin.
Pigmentler için tutma faktörünü veya Rf değerlerini hesaplayın, bu da söz konusu pigmentin kağıdı çizgiden yukarı doğru hareket ettirdiği mesafeyi, çözücünün kağıdı çizgiden yukarı doğru hareket ettirdiği mesafeye bölerek yapılır.
Bu verileri Tablo 1'e kaydedin. NOT: İkinci deneyde, fotosentez ve solunumun dolaylı bir ölçümü olarak yüzen ve batan yaprak disklerini gözlemlediniz.
Sonuçları, x ekseninde zaman ve dakika ve y ekseninde kayan disk sayısı ile grafiklendirin. Su kontrolünü ve bikarbonat arıtımını temsil etmek için iki farklı çizgi kullanın.
Disklerin aydınlık durumdan çıkarıldığı ve karanlığa yerleştirildiği noktayı belirtmek için grafiğe bir çizgi ekleyin.
Ardından, bikarbonat durumundan başlayarak, yaprak disklerin %50'sinin yüzdüğü noktayı belirlemek için grafiği kullanın. Bu, etkili süre veya ET50 olarak adlandırılır. NOT: Disklerin muhtemelen aydınlık durumda bir kez ve ardından karanlık durumda tekrar %50 kayan işaretine çarptığını fark edeceksiniz.
Su numuneleriniz ET50 işaretine ulaşmış olabilir veya ulaşmamış olabilir. Yaptılarsa, bu örnek için satırı da ekleyin.
Son olarak, ET50 değerlerinizi ve grafiklerinizi sınıfın geri kalanıyla karşılaştırın.
Q1: Why do different pigments travel at different rates during plant pigment chromatography?
Different pigments have varying solubility in the chromatography solvent, causing them to travel at different rates up the paper. Pigments that dissolve more readily in the solvent move faster and travel farther, while less soluble pigments move slower. This separation allows you to identify individual pigments by calculating their retention factor (Rf) values and comparing them to literature standards.
Q2: What does the retention factor tell you about a pigment in chromatography?
The retention factor (Rf) is calculated by dividing the distance a pigment traveled by the distance the solvent traveled. This ratio is consistent for each pigment under the same conditions, allowing you to identify unknown pigments by comparing your calculated Rf values to reference values in literature tables. Higher Rf values indicate pigments that are more soluble in the solvent.
Q3: How does vacuum infiltration help measure photosynthesis in leaf discs?
Vacuum infiltration removes air from leaf tissue spaces, allowing the discs to sink initially. During photosynthesis, oxygen produced by the leaves fills these air spaces, causing the discs to float. By counting floating discs over time, you indirectly measure the rate of photosynthesis. This method also allows observation of cellular respiration quantification using microrespirometers procedure when comparing light and dark conditions.
Q4: Why do leaf discs sink in the dark during the floating disc experiment?
In darkness, photosynthesis stops and leaf cells perform cellular respiration, consuming oxygen from the air spaces in leaf tissue. As oxygen is depleted, the discs become denser and sink. This demonstrates that photosynthesis, not respiration alone, produces the oxygen that causes discs to float in light conditions.
Q5: What is the purpose of using bicarbonate solution versus water in the leaf disc experiment?
Bicarbonate solution provides additional carbon dioxide to fuel photosynthesis, increasing the rate at which leaf discs produce oxygen and float. The water control lacks this extra CO2 source, allowing you to compare photosynthetic rates between the two treatments. This comparison demonstrates how substrate availability affects the rate of photosynthesis.
Q6: What does ET50 represent in the leaf disc floating experiment?
ET50 is the effective time at which 50% of leaf discs are floating. By determining when this threshold occurs in both light and dark conditions, you can quantify the rate of photosynthesis and respiration. Comparing ET50 values between bicarbonate and water treatments reveals how substrate availability influences photosynthetic rate.
Q7: How do you prepare chromatography paper to separate spinach leaf pigments?
Draw a pencil line two centimeters from the paper's bottom, then roll a fresh spinach leaf over this line using steady pressure with a coin. This transfers pigment onto the paper as a concentrated band. The paper is then suspended in chromatography solvent, which travels up the paper and carries pigments at different rates, creating separated bands of distinct colors.