32.6: Hücre Altı Fraksiyonlama

Hücre lizizinden sonra elde edilen homojenat, hücre içi fraksiyonlama yoluyla daha da saf fraksiyonlara ayrılabilen çeşitli membrana bağlı organelleri içerir. Bu izolatlar belirli hücresel bileşenleri incelemek, lokalize protein aktivitesini analiz etmek ve hatta teşhis amaçlı olarak kullanılır. Fraksiyonlama tipik olarak santrifüjleme yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilir; en yaygın olanı yoğunluk gradyanı ve diferansiyel santrifüjlemedir.

Diferansiyel Santrifüj

Diferansiyel santrifüjleme, hücresel bileşenleri boyut ve yoğunluğa göre ayıran nispeten basit bir yöntemdir. Artan hızlarla (10.000 X g ila 150.000 x g arasında değişen) sıralı santrifüjleme, farklı boyuttaki bileşenleri çökeltir. Bununla birlikte, birden fazla organel benzer boyut ve yoğunlukta olabildiği için bu yöntem genellikle ham fraksiyonlar üretir.

Yoğunluk Gradyan Santrifüjü:

Hücresel bileşenlerin yüksek oranda saflaştırılmış fraksiyonları, homojenatın bir yoğunluk gradyan solüsyonunda ayrılmasıyla elde edilebilir. Bir santrifüj tüpünde, giderek yoğunlaşan sakkaroz çözeltileri gibi yoğunluğu artan çözeltilerin, en yoğun katman tüpün alt kısmında olacak şekilde katmanlanmasıyla bir yoğunluk gradyanı hazırlanır. Bu tür gradyanlar, hücresel organelleri boyutlarına ve şekillerine göre ayırmak için hız-bölgeli santrifüjlemede kullanılır. Santrifüjleme sonrasında organeller, farklı yoğunluk katmanları boyunca hareket ettikçe, sedimantasyon katsayılarına bağlı olarak farklı oranlarda çökelir.

Alternatif olarak, farklı yoğunluktaki çözeltilerin tüpün uzunluğu boyunca kademeli oranlarda karıştırılmasıyla sürekli bir yoğunluk gradyanı da hazırlanabilir. Santrifüjleme sırasında her bileşen, yoğunluklarıyla eşleşen pozisyonda, yani denge pozisyonunda hareketsiz kalır. Bu nedenle bu yöntem aynı zamanda denge veya yüzer çökeltme olarak da bilinir. Hücresel bileşenlerin ve moleküllerin bu şekilde ayrılması, boyutlarına değil, yoğunluklarına bağlıdır.

Hücre altı fraksiyonlama, bir hücre lizatından farklı hücre organellerinin saf fraksiyonlarını elde etmek için kullanılır.

Hücre altı fraksiyonlama için yaygın olarak kullanılan iki yöntem, diferansiyel santrifüjleme ve yoğunluk gradyanlı santrifüjlemedir.

Diferansiyel santrifüjleme, organellerin boyuta dayalı olarak ayrılması için giderek artan hızlarda sıralı santrifüjleme kullanır.

İlk olarak, numune, çekirdekler ve hücre kalıntıları gibi büyük yapıları çökeltmek için yaklaşık 400 ila 600 x g gibi düşük bir hızda santrifüjlenir.

Daha sonra süpernatant, 10.000 ila 20.000 x g arasında değişen yüksek hızda mitokondri, lizozomlar ve peroksizomlar gibi pelet organellerine döndürülür.

80.000 x g'dan daha yüksek hızlarda daha fazla santrifüjleme döngüsü, mikrozomları, zar fraksiyonlarını ve hatta ribozomları ayırabilir.

Bununla birlikte, diferansiyel santrifüjleme, mitokondri gibi boyut veya yoğunluk olarak çok yakın organelleri peroksizomlardan ayıramaz.

Bu gibi durumlarda, daha hassas bir yöntem olan yoğunluk gradyanlı santrifüjleme değerli bir araçtır.

Bu yöntem, kimyasallar kullanılarak oluşturulan yoğunluk gradyanlarını kullanır

organelleri tek bir tüp içinde boyut, şekil veya yoğunluğa göre farklı katmanlara ayırmak için sakaroz veya gliserol gibi.