Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, amacrine hücreleri gibi retinal nöronların, hücrelerin morfolojisi dikey dilimler halinde ağır hasarlı olması gerekiyordu ki, yatay dendritler genişletmek. Bütün montaj hazırlanmasında, özellikle yama klemp kayıtları için, orta tabaka retina nöronlar glial hücre (Müller hücre) ler endfeets geniş kapsama alanı nedeniyle kolayca erişilebilir değildir. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar. Retina düşük sıcaklık erime agaroz jel gömülü sonra dilim vibratome dilimleme makinesi kullanarak retinanın iç tabakası yatay olarak yapılmıştır. Retinanın bu yatay dilim hazırlanmasında, yama klemp kayıt, kalsiyum görüntüleme tekniği, immünhistokimya ve RT-PCR tek hücreli kullanarak, kendi morfolojisi ile karşılaştırıldığında retinal nöronların fonksiyonu okudu.
Protokol
- Agar bloğu (30 mg / ml, yani% 3, distile su) hazırlayın. Çözülür ve mikrodalga ilk ve bir cam tabak içine dökün. 4 ° C'de buzdolabında çanak tutun
İpucu: agar blok önceden hazırlanmış olmalıdır.
- Hazırlayın düşük sıcaklık eritme agaroz jel (orta, 25 mg / ml, yani% 2,5 'i,). Çözülür ve mikrodalga. 35 ° C'de sıcak su banyosunda tutun
İpucu: agaroz jel çok sıcak NOT tutun. Çok sıcak ise, bu katılaşmış olması için uzun bir süre alır ve jel retinanın öldürebilir
. - Hayvan, aydınlatmak bir göz küresi Euthanize ve Göz yuvası gibi açın. Vitreus mizah sıvılaştırılması için açılan Göz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Retinanın yatay dilim hazırlık birçok önemli avantajları vardır.
İlk olarak, amacrine hücreleri ve yatay hücreleri gibi, yatay dendritler genişletmek hücrelerin morfolojisi, korunur. Bu hücrelerinin morfolojisi fizyolojik özelliği ile karşılaştırmak için oldukça önemlidir, böylece 20 farklı tipte (MacNeil ve Masland, 1998), retina amacrine hücreleri üzerinde olduğu kanıtlanmıştır.
İkincisi, tüm montaj retinada, glial hücre s endfeets geniş kapsama alanı, yama pipetler erişim amacrine hücreleri engeller. Amacrine hücrelerinin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm deneysel protokolleri hayvan kullanımı için sağlık kuralları National Institutes göre yapılmıştır.
Teşekkürler
Biz Dr teşekkür ederim. Retinanın yatay dilim hazırlama prosedürü kurmak için bize değerli tavsiyeleri ve önerileri veren Richard H. Masland ve Akimichi Kaneko.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agaroz L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Düşük sıcaklıkta eriyen agaroz |
| Hiyalüronidaz | Sigma-Aldrich | Tip I-S, 300 U/mg | |
| Besiyeri | mM cinsinden: 102 NaCl, 3.1 KCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3 ve 10 glikoz, pH 7.8'de tutulmuş veya Ames’ Çözeltisi (Sigma) | ||
| Mikrodalga fırın | |||
| Sıcak su banyosu | 35 °C | ||
| Vibratom dilimleyici | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membran filtreler | EMD Millipore | HAWP01300 | Filtre kağıdı, gözenek boyutu 0.45 µm |
| Diseksiyon aletleri | pens, bistüri ucu, kıskaç, cımbız, vb. | ||
| Hızlı yapıştırıcı | örneğin Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Şırınga | |||
| Şırınga filtresi | EMD Millipore | SX0001300 |
Kaynaklar
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
