Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

Özet

Bu protokol incelemek için nasıl gösterir Drosophila Immünhistokimya ve / veya nöromüsküler kavşak görüntüleme için hazırlık larvaları.

Protokol

Başlamadan önce

1. Bütün kültürler, 25 ° C'de yetiştirilebilir.
2. HL3.1 diseksiyonu tampon önceden hazırlanmış olabilir. HL3.1 50 ml'lik bir kısım alın ve buz üzerinde tutmak.
3. HL3.1 15 ml taze% 3.5 Formaldehit hazırlayın. Buz üzerinde tutun.

Larvaların Diseksiyon

1. Diseksiyon plaka HL3.1 soğuk bir damla koyun. Bu daha kolay çalışmak için hayvan kurutma ve sersemletici hayvan tutacaktır.
2. Uzun forseps kullanarak, dolaşıp üçüncü instar larva seçin ve HL3.1 açılan yerleştirin.
3. Öncelikle, bir minutien pin kavramak için kısa forseps kullanabilir. Posterior spiracles arasında pin yerleştirin. Hayvan genellikle kendini germe ve ağız kanca yakın larva başkanı kare bir pin yerleştirmek için daha kolay hale pin sürünerek çalışacağız. Hayvan boyuna uzat. Bu kesim sırasında elde edebilirsiniz maruz kalan vücut duvarının miktarını en üst düzeye çıkarmanıza yardımcı olacaktır. Not: ilk baş pin seçerseniz, pim etrafında hayvan vücudu sarmak ya da zor pin ileri ve geri vücut kırbaç. Genellikle HL3.1 kaldırılması ve yine çarpıcı yeni bir soğuk damla hayvan koyarak bu sayaç. Ambidextrous bilim adamı aynı zamanda sadece hayvan yakala ve bir yerde tutun.
4. Yaylı makas kullanma larva dorsal tarafta posterior pin sadece ön yatay bir kesi yapmak. Kesi içine bir bıçak, makas ve larva rostral sonuna doğru dorsal orta hat boyunca dikey bir kesim yapmak. Hayvan kürsüden, sol ve sağ pin yatay kesiler olun. Not: bitmiş sonucu rostro ekseni boyunca larva dorsal tarafında I gibi görünmelidir.
5. Organları çıkarın. Larva HL3.1 birkaç ek damla koyarak başlayın. Bu organlar vücudun çok daha kolay bunları kaldırmak için izin float sağlayacaktır. İlk olarak, trakeal sistemini kaldırmak. İkincisi, organların geri kalanı kapmak için forseps kullanabilir ve bunları kaldırmak.
6. 3. adımı sırasında vücut duvarında, bir sol flep ve sağ flep yaptı. Pin vücut duvarı hem yatay hem de dikey olarak uzatmak için emin olmak için bir saat sipariş kapakları.

Tespit

25 dakika HL3.1% 3.5 formaldehit her hayvan sabitleyin. 5 dakika boyunca iki kez HL3.1 hayvan yıkayın.

Depolama

Pimleri çıkarın ve 1,5 ml tüp 1X PBS içeren bir larva transferi. Erimiş floresan etiketlerini kullanarak NMJ görüntü planlıyorsanız, iki gün içinde görüntü hayvanlar. 4 ° C'de bir hafta için disseke larvaları saklayabilirsiniz

Temsilcisi sonuçları

Uygun bir şekilde diseke Drosophila larva birkaç anahtar bileşenleri vardır. Birincisi, özellikle kaslar, kasların 4, 6, ve 7 zarar görmemesi için ekstra dikkat etmelisiniz. Bu çalışma için en popüler kas ve zarar görmüş, fileto hazırlık atmak ve başka bir hayvan teşrih. İkincisi, bir hayvan, her bir kas ve NMJ maksimum ayırt edilmesi, böylece gergin olduğunu emin olmalısınız.

Tartışma

Bu videoda gösterilen diseksiyon tekniği çeşitli deneysel teknikler Drosophila larvaları hazırlamak için kullanılabilir. Flüoresan protein etiketleri varsa, larva monte ve anında görüntülü olabilir. Aksi takdirde, immün belirli sinaptik bölmeleri işaretlemek için yapılabilir. Buna ek olarak, elektrofizyoloji kolayca nörotransmisyon işleyişini değerlendirmek için disseke larvaları olabilir.

Drosophila NMJ temel yapısı ve işlevi aydınlatılan ilk çalışmalarda bu yana büyük bir...

Malzemeler

HL3 Diseksiyon Tampon: (mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehaloz, sakaroz, 115 ve 5 Hepes, pH 7.3.
Sylgard Diseksiyon Plaka: yavaşça karıştırın (kabarcıkları önlemek için) bir beherdeki 10:01. Petri kabı (herhangi bir boyutta) içine karışımı dökün. SylGard 37C inkübatör geceleme tedavisi için izin ver.