Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Gözlem ve dinamik hücresel süreçleri karakterize, statik görüntüler elde edilemez hücresel aktivite ile ilgili önemli bilgiler verebilmesidir. Vital floresan probları, özellikle yeşil floresan proteininin (GFP), özel hücre içi bölmeleri ve hücresel yapılar etiket yeteneği kaynaklanan hücre biyolojisi alanında devrim yarattı. Örneğin, GFP (ve spektral çeşitleri) kimeralar canlı görüntüleme, organizma ve hücre tipleri [1-3] çok sayıda hücre iskeletinin, organel taşıma ve membran dinamikleri dinamik bir analizi için izin verdiler. Canlı görüntüleme yaygın olmasına rağmen, bu yaklaşım, özellikle de primer kültürlerinde nöronlar hala birçok teknik zorluklar teşkil etmektedir. Karşılaşacağı zorluklardan birinin, post-mitotik nöronlar GFP etiketli proteinlerin bir deyimdir; diğer photobleaching ve genel hücre sağlığı korumak, fototoksisite en aza indirirken, floresan görüntü yakalama yeteneğidir. Burada ise tamamen kutuplaşmış nöron görüntüleme için idealdir, nispeten düşük transfeksiyon oranı (~% 0.5) veren bir lipid tabanlı transfeksiyon yöntemi tanımlayan bir protokol sağlar. Anterograd v. retrograd yönlülük, ulaşım, yani tek bir akson ve dendritler onaylamak için hücre gövdesi yönlendirme olarak karakterize edilebilir böylece düşük transfeksiyon oranı çok önemlidir. Nöronlar ifade görüntüleme GFP Bizim yaklaşımımız, bir CCD kamera, görüntü yakalama yazılımı, ve ısıtılmış bir görüntüleme odası ile donatılmış bir standart geniş alan floresan mikroskop dayanmaktadır. Biz, herhangi bir özel optik veya floresan ışık kaynağı dışında uyarma gereksinimleri olmadan, örneğin, yoğun çekirdekli veziküller, mitokondri, büyüme konileri, aktin organellere veya yapıların geniş bir yelpazede görüntülü var. Ayrıca, spektral-farklı floresan ile işaretlenmiş proteinler, örneğin, GFP ve proteinler dsRed etiketli, ortak taşıma veya diğer koordineli hücresel olayları karakterize etmek için aynı anda yakın görüntülenmiştir olabilir. Burada açıklanan görüntüleme yaklaşım görüntüleme uygulamaları çeşitli için esnek ve nispeten daha az maliyetli bir laboratuvar tarafından kabul edilebilir bir mikroskop kullanılabilir sağladı.
Protokol
Bölüm 1: Lipofectamine 2000 (Invitrogen) kullanarak nöronların Transfeksiyon
Ekipman set-up:
Sıçan veya fare hipokampal nöronlar Kaech ve Banker, 2006 göre kültür [4]. Transfections için kullanılan tipik bir hücre yoğunluğu 250.000 cells/6-cm yemektir. Gerekli reaktifleri ve ekipman 50 mM kynurenic asit, düzenli bir masa üstü tüp tutucu, bir benchtop soğutucu (en iyi Lipofectamine reaktif soğuk tutmak için),
Lipofectamine reaktif, MEM, mikrofuge'de tüpler, micropipetters, ve steril forseps.
Prosedür:
- Her bir Transfeksiyonu etiket için iki adet 1,5 ml tüpler; transfe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Canlı hücre görüntüleme kültürlü nöronlarda organel taşıma doğrudan gözlem için zor, ama güçlü bir tekniktir. Güçlükleri kültür komplikasyonlar nedeniyle yoksul nöron sağlığı ile prosedür yukarı çıkabilir. Bu nedenle, hücre sağlığı (örnekler için bkz. Ref. 4) büyüme ortamında doku kültürü ışık mikroskobu kullanılarak lamelleri gözlemleyerek transfeksiyon öncesi ve sonrası değerlendirilmelidir. Aktarılması süreci nöron içeren görüntüleme odasına lamelleri hücrelere stresli olabilir, böylece lamelleri işlenirken özen önem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Harald Hutter ve Helena Decker Biz bu yazının dikkatli bir okuma için teşekkür ederiz. Biz de kendi teknik uzmanlık için Leica Microsystems Reg Sidhu teşekkür ederim. Bu araştırma, Ulusal Bilimler ve Mühendislik Konseyi, Kanada Ödülü # 327.100-06, Bilim ve Simon Fraser Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Earle tuzları ve L-glutamin içeren MEM-Eagle | Reaktif | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reaktif | Invitrogen | 11668-027 | Transfeksiyon reaktifi |
| Ca2+ ve Mg2+ içeren 10X Hanks | Reaktif | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | Canlı görüntüleme besiyeri |
| 1M HEPES | Reaktif | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | Canlı görüntüleme besiyeri |
Kaynaklar
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective trans....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
