Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

7.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/1170

⸱

13 Nisan 2009

 ,  , 
1Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm 3

Protokol

Bölüm 1: Arna etiketleme: boyaların amino alil kaplin

  1. 1.5mL mikrosantrifüj tüpler içine Arna örnekleri 1μg ekleyin.
  2. Tamamen kuruyana kadar, hiç olmaması veya düşük ısı örnekleri kuru vakum. En kısa sürede kuru olarak her tüp kap - overdry yok!
  3. Her bir tüp 9μl kaplin tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca yavaşça karıştırın Arna tekrar süspansiyon haline getirin. Tüpün alt örnek toplamak için kısaca santrifüjleyin ve sonra örnek buz üzerinde bekletin.
  4. Cy3 veya Cy5 boya her tüp 22μl yüksek kalite DMSO ekleyin. Bir tüp boya 2 örnek için yeterli. Referans örnekleri etiketleme için Cy3 boya ve Cy5 boya, test örnekleri etiketleme için.
  5. Iyice karıştırın boyalar Vortex. Kullanıma hazır olana kadar koyu boyaları tutun. Kullanmadan önce 1 saat daha erken boya hazırlamak etmeyin. Herhangi bir noktada boya / DMSO karışımı hiç su alır emin olun.
  6. Her bir numune için hazırlanan DMSO / Cy boya 11μl ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız.
  7. 30-45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Kalay ile Kapak örnekleri veya ışığa maruz kalmanın en aza indirmek için bir çekmecede saklayın.
  8. Inkübasyondan sonra, tepkisini gidermek için her bir örnek 4.5μl hydroxlyamine ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız.
  9. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kalay ile Kapak örnekleri veya ışığa maruz kalmanın en aza indirmek için bir çekmecede saklayın.

Bölüm 2: Arna temiz-etiketli

  1. Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için.
  2. Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın (Tablo 1) .
  3. Vorteks ile iyice karıştırın.
  4. En az 10 dakika süreyle, 50-60 ° C'de bir 1.5mL tüp ve inkübe Arna Elüsyon Tampon Aliquote.
  5. Her bir örnek 70μl Arna bağlayıcı karışımı ekleyin ve 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme iyice karıştırın.
  6. PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın.
  7. Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın.
  8. Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın.
  9. Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın.
  10. Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. Süpernatant parlak pembe ya da tüzel kişiliği olmayan boya molekülleri nedeniyle bu noktada bir parlak mavi olmalıdır.
  11. Manyetik stand plaka çıkarın.
  12. Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın.
  13. Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın.
  14. Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
  15. Manyetik stand plaka çıkarın.
  16. Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile 2. kez tekrarlayın.
  17. 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin!
  18. Her numune için 20μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir.
  19. 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor.
  20. Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş, etiketli Arna örnekleri içerir ve bir soluk pembe ya da soluk mavi olmalıdır.
  21. Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın.
  22. (Opsiyonel adım) Mikroarray modülü kullanılarak NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinde RNA konsantrasyonu ve boya miktarını kontrol edin.
  23. Hemen sizin seçtiğiniz bir mikroarray platformu üzerine etiketli Arna melezleşme ya da alternatif olarak, -80 etiketli Arna depolamak ° C hibridizasyon için hazır olana kadar.

Tablo 1 Arna Bağlama Mix

Reaktif 1 reaksiyon için Tutarı
RNA Cilt Boncuk * 10μl
Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * 4μl
% 100 izopropanol ** 6μl
Arna Cilt Tampon Konsantre 50μl

* RNA bağlayıcı boncuk Mixilk boncuk tabanda çözüm
** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kritik Adımlar

Amino alil kaplin yaparken, kaplin önce kısa bir süre DMSO (1 saatten az) boya tekrar süspansiyon ve aktif boya grubu ile reaksiyona girer hiçbir su, boya / DMSO karışımı içine alır sağlamak için kritik öneme sahiptir. RNA (1-2uL yerine tamamen kuru aşağı kurutulmuş olabilir) overdry ve kaplin tampon tekrar süspansiyon haline getirin. Kaplin reaksiyon sırasında, zaman zaman Flicking, karanlıkta reaksiyon tutmak ve istenirse aşağı doğru döndürün.

Uygula...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CyDye Etiketleme Sonrası Reaktif Boya PaketiReaktifGE HealthcareRPN5661Hem Cy3 hem de Cy5 boyalarını içerir
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spektrofotometresiDiğerNanoDropND-1000Veya eşdeğer bir spektrofotometre

Kaynaklar

  1. Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA aretlemeMikroarray AnaliziHeLa H creleriZaman Serili EnfeksiyonRNA zolasyonuFloresan Boya Ba lamaManyetik Boncuk ile Safla t rmaNanoDrop Spektrofotometrisi
Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.