Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik
Bu makalede
Özet
Özet
Ligand kapılı iyon kanalları sinir sistemi 1 sinaptik iletişim yatar. Memelilerde ligand kapılı kanallar üç aile vardır: CYS döngü, glutamat-kapılı ve p2x reseptör kanal 2. Her iki durumda da verici bağlayıcı ionlar elektrokimyasal gradyanlar aşağı akan bir gözenek açılması yol açar. Birçok ligand kapılı kanallar da downstream kanal açma süresini aşamaz rolleri sinyalizasyon 5 (örneğin gen regülasyonu) kalsiyum iyonları 3, 4, geçirgen. Böylece ligand kapılı kanallar gün birkaç milisaniye arasında değişen geniş bir zaman ölçekleri üzerinde sinyal. Ligand kapılı iyon kanalları kendilerini proteinler tarafından düzenlenir anlamak için gerekli olduğunu ve bu proteinlerin nasıl bu önemli rolleri dikkate alındığında sinyal ayar olabilir. Son çalışmalar, pek çok, hepsi değilse de, kanal protein sinyalizasyon kompleksleri 6 parçası olabilir ki öneririz . Bu yazıda, P2X2 reseptör sitozolik etki C-terminal yönlerine bağlayan proteinleri tespit etmek için nasıl.
P2x reseptörler ATP açılıp kapanan katyon kanalları ve yedi alt birimden (P2X1-P2X7) oluşur. P2x reseptörler eksitatör sinaptik iletim ve nörotransmiter sürüm 7 presinaptik kolaylaştırma arabuluculuk beyin, yaygın olarak ifade edilir. P2x reseptörleri heyecanlanır ve non-Uyarılabilir hücrelerinde bulundu ve nöronal sinyalizasyon, inflamasyon ve kardiyovasküler fonksiyon 8 kilit roller arabuluculuk. P2X2 reseptörler, sinir sistemi 9 bol ve bu çalışmanın odak vardır . Her p2x altbirim ekstraselüler bölge 7 ve hücre içi N ve C Termini (Şekil 1a) 7 ile ayrılmış iki membran kapsayan kesimleri (TM1 ve TM2) sahip olduğu düşünülmektedir. P2x alt birimden 10 (P2X1-P2X7), amino asit düzeyi 11% 30-50 dizisi homoloji göstermektedir . P2x reseptörleri iyonotropik reseptörler arasında basit stokiyometri sadece üç alt birimden içerir. P2X2 C-terminalindeki 120 amino asitler oluşur (Şekil 1b) ve P2X2 reseptör sinyal komplekslerinin parçası olabileceği hipotezini destekleyen birkaç protein yerleştirme konsensüs siteleri içerir. Ancak, çeşitli işlevleri P2X2 reseptörleri 9 C-terminalindeki atfedilmiş olmasına rağmen hiçbir çalışma moleküler ortakları açıklanan bu proteinin hücre içi tarafında tam uzunlukta C-terminalindeki üzerinden çift. Bu yöntem kağıt tam uzunlukta C-terminalindeki P2X2 reseptörleri ile etkileşen proteinleri tespit etmek için bir proteomik yaklaşım açıklar.
Protokol
DENEYSEL PROSEDÜRLER
(Şekil 2) deneysel işlemin kademeli bir şekilde aşağıda açıklanan dört bölümden oluşmaktadır.
Bölüm 1: P2X2 reseptörlerinin C-terminalindeki Subcloning ve ifadesi.
Biz onu bağlar beyin proteinleri tespit etmek için tam uzunlukta bakteriler P2X2 reseptörleri C-terminus dile getirdiler.
- P2X2 reseptör (Şekil 1) C-terminalindeki pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) klonlanmış (kalıntıları 353-472) ve sıralama ile doğrulanmış, PCR ile amplifiye oldu.
- Rekombinant plazmid E. dönüştü Rekombinant proteinler ifade coli (BL21).
- Plazm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İyon kanalları büyük bir integral membran proteinleri sınıfı. Onlar kendi elektrokimyasal gradyanlar aşağı seçici plazma zarından iyonların hareketi izin su dolu gözeneklerin içerir. İyon kanalları kapısı açık ve kapalı devletler arasında. Yolluk adım p2x ligand kapılı iyon kanalları halinde vericileri (örneğin ATP) tarafından tetiklenir, ya da diğer proteinler ile etkileşimler tarafından düzenlenmiş olabilir. Son on p2x reseptörler ATP 13 bağlama nasıl anlayışımızı bir artışa tanık olmuştur, ama p2x fonksiyo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
SW ve TMV Ulusal Sağlık Enstitüleri NCRR ve NHLBI tarafından desteklenmektedir. BSK ve HS, Ulusal Sağlık Enstitüleri NINDS ve NIGMS tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Asetonitril | Reaktif | JT Baker | 9829-02 | |
| Akrilamid | Reaktif | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampisilin | Reaktif | VWR international | VW1507-01 | |
| Amonyum bikarbonat | Reaktif | Fluka | 09830 | |
| Amonyum persülfat (APS) | Reaktif | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenozin trifosfat (ATP) | Reaktif | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reaktifi | Reaktif | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromofenol mavisi | Reaktif | Fisher Scientific | B-392 | |
| Coomassie blue R-250 | Reaktif | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Ditiyotritol (DTT) | Reaktif | EMD Millipore | 3860 | |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Reaktif | VWR international | VW1474-01 | |
| Etilenglikol tetraasetik asit (EGTA) | Reaktif | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formik asit | Reaktif | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutatyon Sepharose 4B boncukları | Reaktif | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hidroklorik asit (HCl) | Reaktif | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| İzopropil-beta-D-tiyogalaktopiranozid (IPTG) | Reaktif | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| İyodoasetamid | Reaktif | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Besiyeri | Reaktif | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reaktif | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lizozim | Reaktif | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnezyum sülfat (MgSO4) | Reaktif | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Reaktif | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodyum florür (NaF) | Reaktif | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodyum ortovanadat (Na3VO4) | Reaktif | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reaktif | Fluka | 74385 | |
| Fenilmetansülfonilflorür (PMSF) | Reaktif | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Proteaz inhibitör tableti | Reaktif | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standardı | Reaktif | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkozil | Reaktif | Acros Organics | 61207 | |
| Vidalı kapaklı flakon | Ekipman | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodyum dodesil sülfat | Reaktif | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein jel boyası | Reaktif | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamin (TEMED) | Reaktif | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris baz | Reaktif | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reaktif | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tripsin | Reaktif | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reaktif | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Su | Reaktif | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem kütle spektrometri cihazı | Ekipman | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Sıvı Kromatografi Sistemi | Ekipman | Eksigent | ||
| B-Merkapto–etanol | Reaktif | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Gliserol | EMD Millipore | GX0185-6 |
Kaynaklar
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
