Stromal hücre kaynaklı etkinlik inducing (SDIA) kullanarak embriyonik kök (ES) hücreleri nöroepitelyal öncüleri türetilmesi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
ES Hücre türetilen nöroepitelyal Hücre Kültürleri
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik kök hücrelerin yeni tedavilerin geliştirilmesi için cazip bir araç haline getirir tüm germ hücreleri ayırt etmek için bir potansiyele sahip. Genel olarak, ES hücrelerinin farklılaşma, daha sonra yayılır ve olgun hücre fenotipleri içine ayırt edilebilir olgunlaşmamış progenitör hücreler, ilk oluşturmak için konsept izler. İlk olarak, olgun sinir hücrelerine olgunlaşmamış nöroepitelyal öncüleri ve ikinci, farklılaşma türetme ve genişleme: Bu aynı zamanda sinir hücrelerinin gelişiminde iki önemli adımlar takip ettiği ES hücre kökenli bir nöron için geçerlidir. Neuroectoderm dahil olmak üzere tüm germ hücreleri farklılaşma ortaya koymaktadır embriyoid gövde (EB) oluşumu, ES hücrelerinin sinir atalarıdır üretmek için ortak bir yöntem dayanmaktadır. Kafatası kemik iliği kaynaklı stromal hücreler (1) ile birlikte kültür ES hücreleri tarafından elde edilebilir stromal hücre kaynaklı etkinlik inducing (SDIA), nöroepitelyal hücre gelişimi neden için alternatif ve daha verimli bir yöntem kullanır. , EB oluşumu ve SDIA Her ikisi de, sinir benzemeye düşünülmektedir rozet benzeri yapıların geliştirilmesi, tüp ve / veya nöral krest gibi atalarıdır ortaya koymaktadır. Sinir öncüleri tanımlı kültür koşulları kullanarak belirli nöronlar ve glia hücreleri içine alacak şekilde genişlemiştir ve daha farklılaşmış, izole edilebilir. Burada, üretim ve izolasyon gibi rozet, stromal hücre hattı MS5 (2-5) ile birlikte kültür deneylerinde açıklar.
Protokol
Adım 1
- Plaka mitomisin-C α-MEM medya jelatin kaplı (30 dakika süreyle% 0.01) 6 kuyucuğu 70.000 / cm2 bir yoğunluk MS5 hücreleri (2,5 saat süreyle 10 mg / ml) ggrowth inhibe.
- Hücreleri eklenir ve bir tek tabaka (gece büyüme üzerinde) oluşmuştur, SRM geçmek.
- Elle olan bir şırınga yardımıyla, 27 ES hücre kültürleri ½ G iğne ES hücre kolonileri izole eder.
- MS5 hücreleri (genellikle 6 plaka başına 2-3 koloni), düşük yoğunluklu 1 ml mavi ucu ve plaka koloniler dikkatle Tritrurate.
Not: Embriyonik kök hücrelerin, aynı zamanda, kollajenaz veya tripsin kullanarak enzimatik yayılma alınabilir.
Adım 2
- Rozet içeren koloniler oluşana kadar 14-21 gün MS5 besleyiciler ES hücreleri büyütün.
Not: Değişim medya sık sık. Rozet, sömürge ve SRM (3) 300-500 ng / ml Noggin eklenirse onların oluşumunu büyük ölçüde artabilir dış kenarları genellikle . Bazı farklılaşma protokolleri, SRM N2-medya ile değiş tokuş edilebilir ve hücre özellikleri (2-5) teşvik etmek için, büyüme ya da diğer faktörler ile desteklenmiş.
Adım 3
- Izole etmek ve rozet almak, 27 ½ G iğne mikroskop altında.
Not: kesme ve MS5 stromal hücreler toplama kaçının. Koloniler rozet dolu, bir de tüm koloni ayırabilirsiniz.
Adım 4
- Aspire rozet, kümeler, poli-L-ornitin (% 0.001) ve fibronektin (1 mcg / ml) veya laminin (1 mcg / ml) kaplı 6 kuyu üzerine 1 ml mavi ucu ve plaka bunları bunları dikkatle tritrurate N2-Bir medya genellikle bFGF (20 ng / ml) ile desteklenmiştir. Rozet reform ve genişleyecektir.
Not: hücre yaşamını geliştirmek için, bir tabak damlacıkları küçük kümeler hücre yoğunluğu artırmak için. Bu adım aynı zamanda, hücre özellikleri (2-5) teşvik etmek için ek bir büyüme ya da diğer faktörler ile N2-Bir medya tamamlayan tarafından değiştirilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, SDIA kullanarak insan ES hücrelerinin nöroepitelyal hücreleri üreten ve izole farklı adımları gösteriyor. Bu yöntemin uygulama manifoldu ve belirtilen nöron (örneğin 1, 2, 5-9) üretmek için birçok protokol olmuştur. Rozet anterior fenotip (2, 5, 10) nöral tüp hücreleri benzerler ve aynı zamanda nöral krest atalarıdır (11, 12) içeren düşünülmektedir. Buna ek olarak, belirli faktörler tarafından belirlenen kültür koşulları desenli olabilir çünkü onlar plastisite belirli bir düzeyde muhafaza. Böylece, onlara ES hücre farklılaşması...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| L-Glutamin | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 25030 | ||
| alpha-MEM | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 12571 | ||
| Penisilin/streptomisin | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 10829 | ||
| KnockOut serum ikamesi | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 10828 | ||
| MEM esansiyel olmayan amino asit solüsyonu | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 12383 | ||
| DMEM/F12 | Life Technologies tarafından üretilen GIBCO | 11330 | ||
| N2-A takviyesi | Kök Hücre Teknolojileri | 07152 | ||
| Mitomisin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Tip-A jelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poli-L-ornitin | Sigma-Aldrich | P4957 | %0,01'lik çözelti | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 27 1/2 G iğneli 1 mL şırınga | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A besiyeri | besiyeri | DMEM/F12 + %1 N2-A takviyesi | ||
| Serum ikame medyası (SRM) | besiyeri | Knockout-DMEM + %20 Knockout serum ikamesi + %1 MEM temel olmayan amino asit çözeltisi + 2 mM L-glutamin | ||
| α-MEM besiyeri | besiyeri | α-MEM + %10 FBS + 2 mM L-glutamin + %1 penisilin/streptomisin | ||
| MS5 | hücre hattı | stromal hücreler | ||
| Mikroskop | ||||
| 6 kuyucuklu plakalar | doku kültürü için |
Kaynaklar
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
- Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
- Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
- Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
- Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
- Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
- Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
- Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
- Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
