Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı
Bu makalede
Özet
Özet
Bu video, laboratuarımızda, gelişmekte olan zebrafish beyin (Gutzman ve ark, 2008) viraj ve katlama için gerekli hücre şekli değişiklikleri ve düzenlenmeleri analiz etmek için geliştirdiği yöntem göstermektedir. Böyle bir analiz, omurgalı beynin 3 boyutlu yapısının gelişimi için gerekli olan temel hücre biyolojisi yeni bir anlayış tanıyor ve nöral tüp morfolojilerinden çalışma yeteneğini önemli ölçüde artırır. Embriyonik zebrafish beyin 18 saat sonra döllenme (hpf) başlayarak neuroepithelium şişirmek içinde ventriküller olarak şekillenir. 24 hpf, nöral tüp morfolojilerinden ilk adımları tamamlamalısınız. Burada anlatılan yöntemi kullanarak, bir hücre aşamada embriyo mRNA kodlama membran hedefli yeşil flüoresan protein (memGFP) ile enjekte edilir. Enjeksiyon ve inkübasyonu, embriyo, şimdi 18 ve 24 arasında hpf sonra, agaroz, ters, monte edilir ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Özellikle, floresan görüntüleme için ideal bir sistem haline zebrafish embriyo şeffaftır. Analizler, orta beyin Beyin sınır ve arka beyin odaklanmış olmasına rağmen, bu yöntem 80-100 mikron derinliğe kadar zebrafish herhangi bir bölge analizi için genişletilmiş olabilir.
Protokol
1. Enjeksiyon için mRNA hazırlanması
- Bu prosedürde kullanılan mRNA bir plazmid kodlama CAAX eGFP (memGFP) mRNA transkripsiyonu. İlk plazmid ve ark, 2008 Gutzman göre linearize.
- Sonra mMessage mMachine kiti kullanılarak memGFP mRNA yazıya.
- Ortaya çıkan 1μg/μl için mRNA, kısım, ve mağaza sulandırmak -80 ° C
- Bir hücre aşamada embriyo şerit genişliği ile% 1 agaroz bir enjeksiyon kalıp hazırlayın.
- Enjeksiyon bir gün önce, kadın erkek ayıran çiftleşme kafesleri kurdu.
- Enjeksiyon gününde, enjeksiyon hazırlanmak için bir mikropipet çektirmenin kılcal iğneler kullanarak çekin.
2. MRN....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu video, tek bir hücrenin zebrafish embriyolar içine mRNA enjeksiyon için bir yöntem ortaya koymaktadır. Burada, her bir hücre etiket için bir zar-hedefli GFP kodlayan mRNA kullanın. Daha sonra tek bir hücre çözünürlükte gelişmekte olan beyin nasıl montaj ve görüntü göstermektedir. Bu teknik bize hücre şekil değişikliği, orta beyin arka beyin sınır formasyonu (Gutzman ve ark, 2008) için gerekli olan bir roman türü, bazal daralma çalışmak için izin verdi. Benzer diğer olayların analiz omurgalı morfolojilerinden ve altta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Sive laboratuvarda ilk kez bu tekniği geliştirdi Dr. Jennifer Gutzman çok teşekkür ederiz. Lütfen plazmid kodlama CAAX-GFP mRNA sağlanan Dana-Farber Kanser Enstitüsü Boston, MA de JB Green teşekkür ederiz. Konfokal görüntüleme Whitehead WM Keck Vakfı Biyolojik Görüntüleme Tesisleri'nde gerçekleştirildi. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. EG, bir NSF öncesi doktora bursu ile desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agaroz | Reaktif | Lonza Inc. | 50027 | |
| 3-aminobenzoik asit etil esteri (Trikain) | Reaktif | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Kapiler boru | Araç | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1,0 mm dış çap x 0,5 mm iç çap/fiber 100 mm |
| Silikon vakum gresi | Reaktif | VWR international | W0S717 | |
| Pensler | Araç | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μPipet uçları | Araç | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | Bunlar, 24 hpf embriyolar için uygun boyutlardır. |
| mMessage mMachine transkripsiyon kiti | Reaktif | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polimeraz |
| Zeiss LSM 510 taramalı konfokal | Mikroskop | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Mikromanipülatör | Araç | Narishige International | ||
| Mikroenjektör | Araç | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Mikropipet çekici | Araç | Sutter Instrument Co. |
Kaynaklar
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laborat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
