Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

Özet

Embriyonik fare beyin agrega kültür sistemi için protokolleri açıklanmıştır. Agrega multipotent atalarıdır geliştirmek ve nöronlar, astrositler ve oligodendrosit içine ayırt edebilirsiniz.

Özet

Bir in vitro sistemde, merkezi sinir sistemi olgun nöronlar ve glia (MSS) içine atalarıdır özetlediği geliştirme ve farklılaşma AXO glial etkileşimleri, özellikleri ve multipotent atalarıdır farklılaşma ve oligodendroglial ilerlemesini araştırmak Nörobilimadamları için güçlü bir platform sağlayacak hücresel ve moleküler düzeyde soy hücreleri. Biz burada, serum serbest bir ortamda 3-4 hafta kadar devam edebilir ve nöron glia etkileşim ve MSS miyelinasyonun incelemek için bir model olarak laboratuvarda kullanılan embriyonik sıçan forebrains MSS agrega kültür sistemi açıklanmaktadır. Bu video klibi, E16 sıçan beyin bu MSS agrega kültürleri izole ve büyümek nasıl göstereceğiz. Ayrıca, aynı beyin diseksiyonu, zenginleştirilmiş düzenli ayrışmış nöronal kültürlerin kolayca elde edilebilir ve çeşitli çalışmalar için kullanılan merkezi sinir sistemi nöron veya diğer hücreleri ile birlikte kültürler için kullanılır.

Protokol

Diseksiyonu önce hazırlanması

Cerrahi aletleri: otoklav ile tüm diseksiyon makas ve forseps sterilize

Lamel temizleme:

1. En az 24 saat süreyle% 33 HCl 1L çim beher tüm lamelleri (çapı 24-plaka 15mm) Soak
2. Kalan tüm HCl kaldırmak için arada bir sallayarak 10 dakika akan su ile yıkayın
3. Millipore su ile durulayın.
4. Suyu boşaltın
5. % 95-98 etanol içinde lamelleri Soak
6. Düz bir plaka ve hava temiz bir doku Transfer lamelleri kuru lamelleri
7. Alüminyum folyo ile kaplayın ve otoklav, lamelleri bir cam behere aktarın
   Not: lameller bu aşamada saklanabilir
8. Kültür plakaları tek tek lamel yerleştirin. Kaplama için hazır

Lamel kaplama:

1. PBS ve filtre sterilize (0.22 mikron) ile 100 x poli-D-lisin (PDL, -20 ° C'de hacimde olarak saklanır PBS içinde% 0.5 sığır serum albumin, 10 mg / ml) stok sulandırınız
2. 1 x 37 2 saat PDL çözüm (~ 0.15 ml / cm ²⁾ ° C bir kuluçka makinesi ile Coat lamelleri
3. PDL çözüm çıkarın ve tamamen steril GKD ₂ O ve kuru lamelleri ile 3 kere yıkayın

Not: lamelleri / plakaları her diseksiyon için yeterli Coat. PDL kaplı lamelleri 4 birkaç hafta saklanabilir ° C

Medya ve çözümler

Diseksiyon orta (DM): 10 mM HEPES (Invitrogan 15630) ile desteklenebilir (HBSS, Invitrogen 14175) steril buz Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (w / o Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} kullanın.

Toplam kültür ortamı,% 2 B27, 1 x Sato, 0.5 mM sodyum piruvat, 0.75mm GlutaMAX, 60μg/ml N-asetil sistein, 5 mg / ml: DMEM/NBB27 orta DMEM / Neurobasal (vol 01:01 hacim) içerir insülin, 10nm d-Biotin ve% 1 penisilin / streptomisin. 100 ml toplam kültür ortamı yapmak için, 50 ml DMEM (w / o piruvat / glutamin, Invitrogen 11960), 50 ml Neurobasal orta (Invitrogan 211.034), 375 ul GlutaMax (100 x 35.050 Invitrogen), 5.5 mg sodyum piruvat karışımı (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogan 17504), 6.3 mg N-asetilsistein (Sigma A8199), Sato hisse senedinin 1 ml d-Biotin stok (4000 x hisse senedi, 40, 25 ul (100 x stok, aşağıya bakınız) PBS içinde mcM alikotları -20 ° C. Sigma B4639), insülin 100 ul (1000 x stok, -20 alikotları gibi saklanan 0.01N HCl 5 mg / ml ° C, Sigma 16.634) ve 1 ml penisilin olarak depolanır. / streptomisin (100 x stok, Invitrogen 15140), filtre sterilize ve 4 saklamak ° C

Sato 100 x stok solüsyonu: 40 ml stok yapmak için: karışımı 40 ml, 400, 400 mg BSA (Sigma A9647), mg apo-transferrin (Sigma T2252) 10 ul (25 mg / ml etanol, progesteron gibi saklanan Neurobasal alikotları -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescine (Sigma P7505) ve sodyum selenit (30 mcM PBS alikotları olarak depolanan -20 ° C, Sigma S5261) 40 ul. -20 ° C'de hacimde Sato stok solüsyonu ve mağaza sterilize filtreleme

Nöron kaplama orta (PM): Neurobasal Orta,% 2 B27, 2mm Glutamin (100x stok, -20 ° C, Invitrogen 25030 saklanır alikotları), 25μM glutamik asit (100 hisse senedi, -20 ° C'de saklanır alikotları) ve% 1 penisilin / streptomisin.

Nöron kültür ortamı (CM): Neurobasal Orta,% 2 B27, 2mm Glutamin (100x stok, -20 ° C'de saklanır alikotları) ve% 1 penisilin / streptomisin.

5-FDU stok: Neurobasal orta 1mm 100x stok, 5-floro-2'-dezoksiuridin (Sigma F0503) and1mM üridin (Sigma U3003). Filtre -20 ° C'de sterilize ve alikot olarak depolanır

Papain sindirim çözüm (diseksiyon önce taze olun):

1. 4ml DM 3.2 mg L-Sistein (Sigma C-7352) çözülür
2. 37 1N NaOH (pH test şeritleri testi) ve su banyosu yer yaklaşık 7.4 pH ayarlama ° C
   Not: (aşağıya bakın) doku sindirim hemen önce bir sonraki adım gerçekleştirin.
3. 20 ünite / ml nihai konsantrasyonu papain
4. (0.22mm) sterilize Filtresi ve su banyosunda 37 ° ° C

Tripsin inhibitörü çözüm (diseksiyon önce taze olun):

1. 20ml DM 0.2 g tripsin inhibitörü (Sigma T7295) çözülür
2. PH kontrol edin ve 1 N NaOH ile ~ 7.4 pH ayarı
3. Sterilize Filtresi ve su banyosunda 37 ° ° C

Beyin Diseksiyon

Kurulum:

• Steril forseps ve makas
• % 70 etanol
• Temizlik kağıt mendil ve diapbankta er pedi
• Bankta rahim ve fetus için buz DM 10cm Petri kapları
• Diseksiyon mikroskobu Buz platformu
• DM ile buz üzerinde 2-3 6cm yemekleri
• 37 ° C su banyosunda sıcak PM

1. Hamile bir Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış bir prosedüre göre Sprague-Dawley sıçan (E16) ve İletişim Komitesi (IACUC) Euthanize
2. Karın bölgesi bebek bezi ped ve Spay alkol sıçan Lay
3. V şeklinde kesi sadece cilt kesim yapmak için karın cilt ve bir makas tutmak için cımbız kullanın
4. Yayıldı dışında cilt ve kas tabakası ile kesmek için başka bir steril cımbız ve makas kullanın
5. Embriyo keseler zincir Özü ve 10cm çanak içine buz DM içeren bir transfer
6. Mikrodiseksiyon makas kullanarak dikkatli bir şekilde her bir embriyo kesesi ve beyinden gelen her embriyo kaldırmak ve bir buz platformu DM temiz bir 10cm çanak içine beyinleri serbest
7. Laminer kaput ve bir diseksiyon mikroskobu altında, orta beyin / arka beyin bölümleri kaldırmak ve meninksler kaldırmak için ince forseps kullanımı, ve bir buz paketi DM yeni bir 6cm çanak temizlenmiş korteks / hipokampus transfer
   Not: Bu aşamada, doku, enzim sindirim için hazırdır .
8. Make papain ve tripsin inhibitörü çözüm ve sterilize
9. Korteks gelen DM aşırı / hippocampi çıkarın
10. Hazırlanan papain sindirim çözüm 4ml ekleyin
11. Tam olarak 5 dakika 50ml tüp tüm içerik aktarma ve bir su banyosunda 37 Falcon tüp yeri ° C
12. Papain çözüm pipet yardımıyla çıkarın
13. 2-3 dk 5ml tripsin inhibitörü çözüm, girdap tüp ve su banyosunda 37 ° ° C
14. Tripsin inhibitörü çözümü çıkarın
15. Adım 13 ve 14 üç kez tekrarlayın
16. 20ml sıcak PM Ekle
17. Tüm kümeleri ortadan kalkana kadar (~ 20-30 kez) Karışım
18. 7dk için 100xg santrifüjleyin
19. 10ml PM pelletini tekrar santrifüj tarafından iki kez yıkayın
20. Düzenli nöron kültürlere veya toplu kültürler için NBB27/DMEM 10ml PM pelletini tekrar
21. 70μm bir hücre eleklerden hücrelerin Pass
22. Canlı hücre sayımı
23. Hücreleri normal nöron kültürler için aşağıda açıklanan veya levha olarak toplam kültürler geçin
    Not: Bu aşamada, yüksek oranda zenginleştirilmiş nöron kültürler deney amacına bağlı olarak yoğunluğu 200-640 hücre / ^mm 2, PDL kaplama plakalar üzerine ayrışmış hücreleri kaplama ile elde edilebilir. Hücreleri (~ 2-4h) bağlı sonra, sıcak PM orta yerine. 4 gün uzun süre, kültür varsa, sıcak CM ile orta yarısı değiştirin. 5-FDU (son konsantrasyon 10 mcM) nöronal kültürlerin, mitoz inhibitörü yüksek derecede saflaştırılmış için (DIV2 3 sırasında yani), non-nöronal hücre proliferasyonunu inhibe etmek DIV2 eklendi olabilir. 2 gün boyunca CM kurtarma sonra hücreler darbe tam bir orta değişikliğinin ardından başka bir 2 gün (DIV 6-7) 5-FDU ile yeniden tedavi edilir. Bundan sonra, taze, sıcak CM, her 3-4 günde bir orta yarısı değiştirin. 4 hafta kadar Nöronlar geçerli değildir.

Agregalar hazırlık ve kaplama

1. 2x10 ⁶ hücre / ml yoğunlukta 1x Sato, 10 ng CNTF ve 10μM forskolin NBB27/DMEM orta ayrışmış hücreleri içeren Askıya Alma
2. Kaplanmamış 6-plaka her kuyuya hücre süspansiyonu 2ml transfer
3. 3 gece Kültür. Her gün, hafifçe bir kez P1000 Pipetman kullanarak hücrelerin tekrar süspansiyon
   Not: Hücreler, agrega (Şekil 1) oluşturmaya başlar .
4. Toplam kaplama bir gün önce, mont plaka / Matrigel ile lamelleri:
   • Stok Matrigel buz soğuk DMEM ile 01:20 (düşük büyüme faktörü, BD Biosciences 354.230) sulandırınız
     Not: Matrigel alikotları üretici protokol başına hazırlıklı olmalıdır. Tüm ipuçları, Eppendorf tüpleri ve stok hacimde yapmak için çözümler Matrigel polimerizasyonu önlemek için soğuk olmalıdır. Matrigel alikotları -80 ° C 4 ° C'de muhafaza ve çözdürülen
   • 37 ° C inkübatör geceleme seyreltilmiş Matrigel çözüm 300μl/well Coat önceden PDL kaplı lamelleri
   • Sıcak PBS ile yıkayın, daha sonra ılık steril GKD ₂ O tabak yıkama ve inkübatör plakaları bırakın.
5. 3 gün toplam oluşumundan sonra hafifçe 50 ml Falcon tüp içine 200μm örgü ile süspansiyon tekrar hücreleri tekrar süspansiyon ve elek. Agrega ağırlık (~ 3-5sn) tarafından tüp altına yerleşmek için izin verin
6. Dikkatle süpernatant kaldırmak
7. Orta ekle, yavaşça agrega tekrar süspansiyon haline getirin ve onları tekrar yerleşmek. Ölü hücreleri tek tek hücreler ve enkaz kaldırmak için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Süpernatantı hala olmayan toplu hücreler ve debri içeren olup olmadığını kontrol etmek için mikroskop kullanın.s
8. Yavaşça aynı NBB27/DMEM orta agrega (Şekil 1) tekrar süspansiyon ve agrega saymak
9. 25-30 etrafında aggreggats/50ul agrega yoğunluğunu ayarlayın
10. Toplam süspansiyon kaplama için 2ml Eppendorf tüplerine transferi alikotları (500-1000μl)
    Not: agrega tüplerin dibine çökmemesi için bu yana, toplam süspansiyon çoklu tüpler kaplama yapmak çok önemlidir. Sık sık benzer her lamel kaplama agrega sayısı sağlamak için, kaplanmış lamelleri veya kültür plakalar üzerine onları ekim önce hafifçe agrega tekrar süspansiyon haline getirin.
11. Inkübatör Matrigel kaplı lamelleri içeren kültür plakasına çıkartın. Her kuyudan çözüm çıkarın lamelleri sıcak PBS ve GKD ₂ O ile yıkayın ve ardından da kuru kısaca . Toplam tohumlama için artık hazır.
12. Bir tüp, onlara tohumlama önce eşit bir şekilde dağıtılacaktır izin agrega süspansiyon içeren tersine çevirin. Her lamel merkezi haline toplam süspansiyon 50μl yerleştirin ve hafifçe agrega lamel eşit takmak için izin başka bir rahatsızlık olmaksızın inkübatör plaka koymak
    Not: agrega yoğunluğu çok önemlidir. Eğer agrega numaralı seribaşı birbirine çok yakın ya da ekim yoğunluğu yüksek ise, onlar büyüdükçe birlikte birleştirme eğilimi gösterirler.
13. Her iyi 4-6 saat sonra ya da erken ertesi sabah ek DMEM/NBB27medium (500 ul)
14. Toplam kültürü korumak için her 3-4 günde bir, yarım orta değiştirmek. Orta değiştirdiğinizde, agrega bozmaya dikkatli olmalı ve bu kuyunun yan duvar boyunca orta ekleyerek hafifçe yapılır.
    Not: Birkaç saat plakasına bağlı agrega sonra, agrega neurite akıbet görülebilir. Aksonlar ilk iki hafta içinde hızla büyümeye ve agrega (Şekil 2) arasında bol bağlantıları oluşturur. Glial atalarıdır agregaların radyal göç ve astrositler ve olgun oligodendrosit içine zamanla ayırt.

Şekil 1 yıkandıktan sonra farklı gün ve agrega agrega oluşturan hücreler Faz kontrastlı görüntüler.

2 ve 12 gün Matrigel kaplı lamelleri numaralı seribaşı sonra toplu bir kültür Şekil 2. Faz kontrastlı görüntüler.

Tartışma

Erken çalışmalar sinaps oluşumu ve dönme-aracılı serbest dalgalı agrega kültürler ¹ olgun miyelin bildirdi. Burada açıklanan MSS agrega kültür sistemi, hücre gelişimi, göç ve in vitro farklılaşma analizi kolaylaştırmak için geleneksel 2B kültürlerin rahatlığı ile üç boyutlu agrega multipotent progenitör hücrelerin serum serbest büyüme birleştirir sistemi, sinir habercisi değiştirilebilir ve kullanılabilir hücre araştırma ve soruşturma nöron glia etkileşimleri. Örneğin, oligodendrosit atalarıdır gibi ...