Yöntem makalesi

Lentivirüs Üretim

DOI:

10.3791/1499

⸱

2 Ekim 2009

 , 
1Diabetes Center, University of California, San Francisco - UCSF

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA enterferans (RNAi) canlı hücrelerin gen susturma bir sistemdir. RNAi, genler homolog kısa müdahale RNA'lar sırayla (siRNA) post-transkripsiyonel devlet susturulmaktadır. Kısa saç tokası RNA'lar, siRNA habercisi, çeşitli hücre tipleri RNAi için izin lentivirüs kullanarak ifade edilebilir. Human Immunodeficiency Virus Lentiviruses, hücrelerin bölünmesi ve non-bölünmesi bulaşmasını yeteneğine sahiptir. Biz paketi lentiviruses bir prosedür anlatacağız. Ambalaj yetkili virüs DNA vektörleri hazırlanması anlamına gelmektedir. Lentiviral vektör üretim sistemleri doğal viral genomun bireysel yardımcı plazmid yapıları bölünmüş olan bir 'bölünme' sistemi dayanmaktadır. Bu dört ayrı vektörleri farklı viral elemanlarının bölme lentiviral genomunun adventif rekombinasyon çoğaltma yeteneğine sahip bir virüs yaratma riski azalır. Burada ilgi ve üç ambalaj vektörler shRNA (p-VSVG, pRSV, pMDL) içeren bir vektör geçici insan 293 hücrelerine transfekte. En azından 48 saatlik bir kuluçka döneminden sonra, virüsü içeren süpernatant hasat ve yoğunlaşmıştır. Son olarak, virüs titresi muhabiri (floresan) bir akış sitometresinde ifade tarafından belirlenir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bölüm 1: Lentiviruses üretmek için HEK 293 Hücre Transfeksiyon

* 24 saat önce% 50-70 ertesi gün confluency için bir 10cm çanak transfeksiyon, plaka 2,5 X 10 6 hücreleri.

  1. Bu protokol virüs yapmak için bir sonraki hücreleri transfect hangi DNA hazırlayarak başlayın. İlk olarak, FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif Roche, hücrelerin DNA sürebilir yapmak bir lipid reaktif seyreltin. 1.5 ml tüp, pipet 30μl FuGENE 6 600ul serum serbest ortama (SFDMEM). Ortama teslim olarak FuGENE tüp tarafında dokunmatik izin vermeyin dikkatli olun. Bu FuGENE ve SFDMEM karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe, 5 dakika izin verin.
  2. Tüpün k....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sandler Astım Temel Araştırma Merkezi (SABRE)
Sandler Vakfı

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM HEK 293T hücreleri Penisilin-streptomisin Glutamin Fosfat tamponlu salin FBSInvitrogen
FuGENE 6 transfeksiyon reaktifi pSico mCherry pMDL pRSV pVSVGRoche Group
BleachClorox
10 cm hücre kültürü kapları 96 kuyulu hücre kültürü kapları Falcon BD353003
Çok kanallı pipetRainin
Filtreli pipet uçlarıRainin
1.5ml Eppendorf tüpleri Şırınga Syinge filtresi (0.45-μ m)Eppendorf
Ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter Inc.
%5 CO2Coulter
Beckman SW41T'de doku kültürü inkübatörü. Beckman
.
Floresan mikroskopCoulter
FACS DizisiBeckman Coulter Inc.
ultrasantrifüj Beckman Coulter Inc.'i rotor yapıyorum

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
  2. Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lentivirus ProductionViral TiterFlow CytometryUltracentrifugationTransfectionPlasmid DNAViral PackagingSerial DilutionFluorescent ReporterBiosafety Regulations

İlgili makaleler