Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Summary

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Abstract

Protein iletim tekniği, memeli hücrelerinin içine biyolojik aktif madde doğrudan teslim sağlar ^[1,2 inceleme için bakınız] . Bu yüzden adı verilen hücre delici peptidler (ABM'lerini) translocating yeteneği kullanmak için, aynı zamanda protein transdüksiyon domain (PTDs) olarak belirlenmiş. Insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) Tat (trans-transkripsiyon aktivatörü) protein yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır türetilen TAT-CPP. Olumlu ücret TAT, böylece hücre zarının endositoz ve / veya doğrudan membran ^penetrasyonu 2 engellerinin aşılması hücre geçirgenliğini artırır . Bir nükleer lokalizasyon sinyal ile birlikte (NLS) füzyon proteinleri çekirdeği sergileyen işlevselliği girebilecekler. Bizim video sunumu hücre geçirgen proteinlerin mühendislik, inşaat, üretim ve geçirgen bir hücre DNA modifiye enzim Cre sürümü uygulaması için bir örneklendirme olarak gösteriyor.

Cre memeli hücrelerinde in vitro ve in vivo olarak 34 baz çifti loxP siteleri tanımak ve rekombinasyona bir siteye özgü recombinase . Bu nedenle Cre / loxP sistemi yaygın koşullu canlı hücreler ^3,4 genom mutasyonları ikna etmek için kullanılır. Ancak, hücreleri aktif Cre recombinase teslim bir sınırlama temsil eder.

Biz, gen-faiz doğrudan bir ekleme verir ve hızla uygun ve standart bir şekilde vektör içinde kullanılan farklı etki alanları ve etiketler clone bir platform sağlar pSESAME vektör sistemi açıklanmaktadır. Farklı etiketler yeniden düzenlenmesi, daha yüksek verim ve daha iyi çözünürlük elde etmek için bir olasılık sağlayan füzyon proteinlerin biyokimyasal özellikleri değiştirmek için gösterilmiştir. Ve E. coli hücre permeant rekombinant proteinleri ifade ve arındırmak için nasıl gösterilmektedir. Rekombinant Cre protein işlevselliğini nihayet hücre kültürü, hücre içi recombinase faaliyet değerlendirerek doğrulanır.

Protocol

Ifade vektör ve ifade İnşaat:

PSESAME Cre ekspresyon vektörü standart klonlama yöntemleri kullanarak AvrII ve NheI kısıtlama siteleri aracılığıyla pSESAME bir Cre-kodlama parçası takarak inşa edilmiştir. pSESAME histidin etiketi, TAT-domain, NLS sırası ve Cre, kısaltılmış HTNCre oluşan bir füzyon proteini kodlar. HTNCre ifade için pSESAME Cre TUNER (de3) pLacI dönüştü ve bir gliserol stok hazırlamak için kullanılan.

1. Bir gece aşırı kültür gliserol stok dönüştürdü bakteri ile kaplı bir pipetlemeyin ucunu kullanarak ekildi. % 0.5 glukoz ile desteklenmiş LB medya oluşan aşırı gece kültür [v / v] ve 50 mcg / mL nihai konsantrasyonda carbenicillin ve 37 büyümeye izin ° C de 16 saat boyunca.
2. Ertesi gün yoğun olarak yetiştirilen üzerinde gece kültürü 1 ila 40 arasında bir oranı ifade kültürünü aşılamak için kullanılan ve 37 ° C'de bir inkübatör konuldu İfade kültürü, son bir 100 mcg / mL konsantrasyonda% 0.5 'lik glukoz [v / v] ve ampisilin ile desteklenmiş TB medya oluşuyordu.
3. OD ₅₉₅ 1.5 ifade kültürü 1 saat için 0.5 mM IPTG ile indüklenen
4. Daha sonra bakteri SLA3000 rotor 10 dakika 5000 rpm'de santrifüj yoluyla toplanmıştır.
5. Bakteriler pelet eksi 20 ° C arıtma kadar saklandı.

Hücre geçirgen protein saflaştırılması:

1. Dondurulmuş bakteri pelet oda sıcaklığında 15 dakika başına 10 litre şişesi kültür mL lizis tamponu yeniden süspanse edildi.
2. Süspansiyon sonra oda sıcaklığında karıştırılması sırasında, ek 15 dakika boyunca 1 mg / ml lizozim inkübe edildi.
3. 25 U / ml Benzonase sonra eklenir ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma inkübe edildi.
4. Gücünün% 45 0,5 darbeleri ile 1.5 dakika süreyle buz sonification sonra, 1 ml soğuk tartarik tuz tamponu (TSB) başına ml süspansiyon dikkatle süre eklendi karıştırma ve buz üzerinde 5 dakika inkübe. SDS-PAGE lizat fraksiyonu (L) örnek alındı.
5. Temizlendi lizat ° C 'de 30 dakika 30.000 g. 4 santrifüj yoluyla elde edildi Çözünür (S) ve çözünmez fraksiyonları (I) SDS-PAGE örnekleri alındı.
6. Süpernatant taze 50 ml şahin tüpler içine transfer oldu ve 4 az 1 saat sonra hafifçe karıştırılır ° C,% 50 Ni-NTA bulamaç ilk ifade kültür litre başına 2 ml.
7. Süspansiyon gravite akışı EconoPac sütunu (fraksiyonu akış ile alınmıştır (FT) SDS-PAGE örnek) ile paketlenir ve 5 yatak yıkama tampon hacimleri ile iki kez yıkandı. Hem yıkama fraksiyonları (W1 ve W2) SDS-PAGE örnekleri alındı.
8. HTNCre içeren fraksiyonlar eluat fraksiyonu (E) SDS-PAGE analizi için elüsyon tampon ve örnek 3 yatak hacimleri ile yıkandı alınmıştır.
9. Imidazol yüksek tuz tamponu iki kez karşı elüsyon fraksiyonu diyaliz tarafından kaldırıldı.
10. Protein solüsyonu gliserol tampon karşı iki kez diyaliz daha fazla konsantre oldu. Tüm diyaliz adımları örnek tampon oranı en az 50 oldu. Bu prosedür, 200 ve 450 mcM arasında bir normal konsantrasyonda HTNCre içeren bir gliserol stok solüsyonu ile sonuçlandı, yani 1 litre ifade kültür ~ 12 mg protein neden olacaktır. Gliserol stoku (GS) SDS-PAGE analizi için örnek toplanmıştır. HTNCre stok solüsyonu eksi 20 saklanabilir ° C

Şekil 1: Cre recombinase saflaştırma işlemi sırasında toplanan örneklerin SDS-PAGE analizi. Cre ifade İndüksiyon lizat fraksiyonu egemen grup tarafından gösterilir. Çözünmeyen protein bir parçası olmakla birlikte, eluat ve gliserol stok kesirler görüldüğü gibi Cre proteini daha zenginleştirilmiş olabilir. L: Lizat: çözünmez, S: Süzüntü FT: Akış, W: Yıkama, E: Eluat, GS: Gylcerol Stok. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Fare embriyonik kök (ES) hücrelerin içine protein transdüksiyon:

1. Bir koşullu β-galaktosidaz muhabiri ⁵ inşa taşıyan ES hücrelerinin yapışık hücrelere disosiasyon için TrypLE ™ Express kullanan tek bir hücre olarak seribaşı. 4 ila 6 saat sonra hücrelerin yeniden bağlı olan ve orta kaldırıldı.
2. Daha sonra ES hücrelerinin, 16 saat süreyle HTNCre içeren orta inkübe edildi.
   • Gliserol stokunun HTNCre protein uygun bir miktar (10 mcM karşılık), ES, orta ve daha sonra steril filtre (0.22 mm) içine sulandırılmış oldu.
3. Protein transdüksiyon orta normal büyüme ortamına geri çevrildikten sonra.
4. Iki gün hücreler PBS ile yıkanmış ve 10 dakika için% 4 Paraformaldehit (PFA) ile fikse edildi.
5. İki ekPBS ile fonksiyonel yıkama adımları X-Gal boyama yapıldı önce idam edildi.
6. Sabit hücreleri X-Gal boyama çözüm ⁶ bir tabaka ile kaplıdır ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edildi.

Temsilcisi Sonuçlar:

Ertesi gün X-Gal boyama çözüm talip oldu ve hücreler PBS mikroskopi analizi için bir tabaka ile kaplıydı. Recombined hücreleri 80 -% 100 β-galaktosidaz aktivitesi tarafından değerlendirilecektir fare ES hücrelerinin içinde gözlenebilmektedir.

Discussion

Cre füzyon protein saflaştırma işlemi sırasında buz TBS tampon ek santrifüj önce atlamak için önemlidir. Aksi takdirde Cre recombinase gliserol tampon içinde çökelti eğilimindedir.

Eluat fraksiyonu haline görünüyorsa çözüm yine ortadan kalkıncaya kadar, füzyon proteini ek elüsyon tampon yüksek konsantrasyonu nedeniyle bulanık eklenmelidir.

10 mcM Cre füzyon protein uygulama genellikle 80 ila% 100 arasında bir rekombinasyon verimlilik sonuçlanır. Fötal Buzağı Serumu (FCS) ES hücre ortamın önemli bir bileşeni olan, güçlü bir şekilde protein transdüksiyon inhibe eder. Cre recombinase Bu nedenle yüksek konsantrasyonda kullanılması gerekiyordu. Serum serbest koşullarda çalışırken daha az protein (0.5 - 2 mcM) benzer rekombinasyon verimliliği elde etmek için kullanılabilir.

Eldeki pSESAME vektör sistemi ile bir Oct4 ve Sox2 ⁷ ve Scl/Tal1 ⁸ gibi transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer proteinler protein iletimi tekniği uygulayabilirsiniz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
TUNER (DE3) pLacI	Novagen, EMD Millipore	70625
Gliserol	Carl Roth GmbH	3783.2
Na2< / sub>HPO4< / sub>	Carl Roth Gmbh	T876.1
Trizma Temel	Sigma-Aldrich	T1503
HCl	Carl Roth Gmbh	4625.1
Imidazol	Carl Roth Gmbh	X998.4
NaCl	Carl Roth Gmbh	9265.2
Maya Özü	Carl Roth Gmbh	2363.4
Trypton/Pepton	Carl Roth Gmbh	8952.4
K2HPO4	Carl Roth Gmbh	P749.2
KH2PO4	Carl Roth Gmbh	3904.1
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9518
Karbenisilin	Sigma-Aldrich	6344.2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Lizozim	Sigma-Aldrich	62971
Benzonaz	Novagen, EMD Millipore
L-Tartarik asit, disodyum tuzu	Sigma-Aldrich
% 50 Ni-NTA bulamacı	Invitrogen	R901-15
EconoPac sütunları	Bio-Rad	732-1010
Steril filtre 0,22 & mu; m	Whatman, GE Sağlık Paraformaldehit
(PFA)	Sigma-Aldrich
LB orta			Maya özütü, Tripton/Pepton, NaCl
TB ortamı			Maya özütü, Tripton/Pepton, Gliserol, K2HPO4, KH2PO4
Lizis Tamponu			50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartarik Tuz Tamponu (TSB)			20 M L-Tartarik asit, disodyum tuzu ve 20 mM Imidazol
Yıkama Tamponu			PTB, 500 mM NaCl, 15 mM İmidazol
Elüsyon Tamponu			PTB, 500 mM NaCl, 250 mM İmidazol
Yüksek Tuz Tamponu			600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Tamponu			%50 gliserol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express	Invitrogen
ESGRO (LIF)	EMD Millipore
NEAA	GIBCO, Life Technologies	tarafından 11140035
L-Glutamin	GIBCO, Life Technologies	25030024
β-Mercapt– thanol	GIBCO, Life Technologies	31350010
DMEM	GIBCO tarafından, Life Technologies	11960044
PBS	GIBCO tarafından, Life Technologies
Fetal Buzağı Serumu (FCS)	PAA Laboratories
X-Gal boyama solüsyonu:			4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal, PBS K'da çözüldü
K3(FeIII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-3367
K4 (FeII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-9387
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
X-Gal	Sigma-Aldrich	B4252