Mikroakışkan bir adacık perifusion cihazı, çok sayıda adacık ve kalsiyum girişini ve mitokondriyal potansiyel değişiklikleri eş zamanlı olarak floresan görüntüleme dinamik insülin salgılanması değerlendirilmesi için geliştirilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Mikroakışkan bir adacık perifusion cihazı, çok sayıda adacık ve kalsiyum girişini ve mitokondriyal potansiyel değişiklikleri eş zamanlı olarak floresan görüntüleme dinamik insülin salgılanması değerlendirilmesi için geliştirilmiştir. Cihaz üç tabakadan oluşur: İlk katman maruz kaldığında, maruz kalan yüzey alanını adacıklar akışı ve en üst düzeye çıkarmak için adacıklar hareketsiz yardımcı microscale kuyular (500 mikron çapında ve 150 mikron derinliğinde) bir dizi içerir; ikinci kat bir genelge içerir perifusion odası (3 mm derinliğinde, 7 mm çapında) ve üçüncü katman bir giriş karıştırma kanal içerdiğini fanlar önce optimize etmek için perifusion odasına enjeksiyon (genişliği 2 mm, 19 mm uzunluğunda, ve yüksekliği 500 mm) karıştırma verimlilik perifusion odasına girmeden önce. Doğrusal bir çan şekli de dahil olmak üzere çeşitli glukoz degradeler, ve kare şekiller oluşturma mikroakışkan perifusion ağı oluşturulacak ve gösterilmiştir.
Protokol
3-katmanlı mikroakışkan perifusion cihazın A. mikroimalat
Alt Eh Master Protokolü (150 mm derin kuyu)
- Gofret gerekirse bir jilet kullanarak temizleyin. Aseton, Metanol ve IPA ile temizleyin. 30 saniye için 50 Watt plazma işlemi gerçekleştirin
- Spin SU8-100 @ 2000 rpm. Adım 1: 500 dak, 10 sn, 100 dev / s, Adım 2: 2000 rpm, 30 s, 300 devir / s].
[NOT: SU8 iplik sonra cımbız ile gofret tutmayın] - Yumuşak fırında 65 gofret ° C 20 dakika ve 95 ° C de 50 dk.
- Gofret, istenilen bir maske aracılığıyla UV ışınlarına maruz kalmaktadır. Doz 150 mikron yükseklik için 650 mJ / cm 2.
- Mesaj maruz gofret 65 ° C 1 dakika ve 95 ° C de 12 dakika pişirin.
- 15 dakika SU8 geliştirici gofret geliştirin.
Mikrokanal Yüksek Lisans Protokolü (500 mm derin kuyu)
- Gofret gerekirse bir jilet kullanarak temizleyin. Aseton, Metanol ve IPA ile temizleyin. 30 saniye için 50 Watt plazma işlemi gerçekleştirin
- Spin SU8-2150 @ 1000 rpm. Adım 1: 500 dak, 10 sn, 100 dev / s, Adım 2: 1000 rpm, 30 s, 300 devir / s].
- Yumuşak fırında 65 gofret ° C'de 15 dakika ve 95 ° C 2 saat ve 30 dakika.
- Gofret, istenilen bir maske aracılığıyla UV ışınlarına maruz kalmaktadır. 650 mikron yükseklik için maruz kalma dozu 685 mJ / cm 2 .
- Mesaj maruz gofret 65 ° C 5 dakika ve 95 ° C de 35 dakika pişirin.
- 20-30 dakika süreyle SU8 geliştirici gofret geliştirin.
PDMS çözüm hazırlığı
- Polidimetilsiloksan (PDMS) çözümü 10 parça silikon elastomer standart bir Sylgard 184 kiti 1 kısım sertleştirici iyice karıştırılarak hazırlanır.
- PDMS çözüm karıştırma işlemi sırasında oluşturulan kabarcıklar, bir vakum desikatörde kullanarak kaldırılır.
- Kabarcık PDMS çözüm yavaş SU8 yüksek lisans ve üçüncü katman için boş bir Petri kabı üzerine sürülür.
- Sıcak plaka sıcaklığı 75 ° C ve PDMS 2 saat bu sıcaklıkta kür
- Uygun boyutta delgeç kullanılarak girişleri, çıkışları ve döviz kuyu açılmıştır.
- Katmanları, bir el plazma cihazı kullanılarak bir cam slayt (büyüklüğü 0.1 mm) bir araya yapıştırılır.
B. deney düzeneği
- Mikro cihaz üzerinden akış% 70 etanol sterilize etmek. Akış DI su etanol yıkayın. Mikrokanallı duvarları olmayan insülin özel adsorpsiyon önlemek için cihaz üzerinden 50 ml% 0.5 BSA serpmek.
- Glukoz rampa degrade ve pompaları gradyanlar kararlı olduğundan emin olmak için test şırınga ile iletişim LabView yazılımı tarafından oluşturulan diğer ilgili gradiyent.
- 37 ° C de 30 dakika boyunca 5 mcM Fura-2/AM (bir kalsiyum göstergesi, Moleküler probları, CA) ve 2.5 mcM rodamin 123 (Rh123, mitokondriyal bir potansiyelleri göstergesi, Sigma, MO) 25-30 fareler adacıklar ile inkübe edildi. 2 mM glukoz içeren Krebs-Ringer tampon (KRB)
- Fareler adacıklar dikkatle giriş bağlantı noktası üzerinden mikroakışkan perifusion cihazı pipetlenir.
- Tygon tüp ve bir Y-konektör ve fraksiyon toplayıcı çıkış kullanarak şırınga pompaları için giriş bağlayarak mikroakışkan ağ kurulumu. Cihaz mikroskop (37 ° C) ısıtma aşamasında oturur ve giriş tüp, 37 oda ve çözüm sıcaklığı tutmak için bir ocak ısıtmalı ° C
- Hemen kurulumdan sonra, farelerin adacıklar KRB sonra, 10 dakika ve 25 dakika glukoz rampası (2mm 25mm) için 2 mM glukoz içeren perifused.
- Zaman atlamalı görüntüleri her 15 sn SimplePCI yazılım tarafından toplanır ve analiz edilir. Perifusate da insülin salgılanması ELISA kiti kullanılarak analiz etmek için bir fraksiyon toplayıcı kullanarak her dakika toplanır.
Temsilcisi Sonuçlar
Fare adacıklar 2-25 mM glukoz doğrusal bir degrade ile perifused. Şekil 1'de gösterildiği gibi, kalsiyum akını ve insülin salgılanması 6 mM glukoz ilgili perifusion yaklaşık 13 dakika sonra tetiklenir. Mitokondrial potansiyelleri değişiklikler, yaklaşık 11 dakika beklendiği gibi daha erken görülür. Bu veri, adacık fizyoloji karakterize etmek için bu mikroakışkan ağını kullanarak avantaj göstermektedir.
Şekil 1: Adacık hücre stimülasyonu için fizyolojik tepkiler .
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Geleneksel adacık perifusion sistemleri (macroscale ve microscale), kurulum ve tasarım, yüksek teknik gereklilikler ve sistem kullanıcı öngörülen kimyasal degradeler oluşturmak için zorluk karmaşık dahil olmak üzere, bazı kısıtlamalar var. Burada açıklanan mikroakışkan perifusion sistemi basit tasarım ve imalat geometri ile bu sınırlamaların üstesinden gelir. Daha da önemlisi, bu sistem adacık fizyoloji çalışmak için benzersiz bir araç olarak sağlayan floresan görüntüleme yaklaşımı ile entegre edilebilir. Yüksek sinyal-...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Bu çalışma, Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) Jose Oberholzer ve Chicago Diyabet Proje AAUW uluslararası burs tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 60ml Şırıngalar | BD Biosciences | ||
| Fura-2 floresan boyası | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Floresan boyası | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glikoz | Sigma-Aldrich | ||
| Sığır Serum Albumini | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silikon borular | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tüpleri | Fisher Scientific | ||
| Y-konnektörler | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Şırınga konnektörleri | Cole-Parmer | dişi luer tapa 1/16” | |
| Düz konnektörler | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Dirsek konnektör | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard şırınga pompası | Harvard Apparatus | ||
| Perifüzyon cihazı | |||
| Isıtıcı tabla | PMC | ||
| Termometre | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraksiyon toplayıcı | Gibson | ||
| Pipetleyici | Fisher Scientific | ||
| Evirme epifloresan mikroskop | Olympus Corporation | IX71 | |
| Yükleme bağlılı cihaz (CCD) | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
Kaynaklar
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
