$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
3-katmanlı mikroakışkan perifusion cihazın A. mikroimalat
Alt Eh Master Protokolü (150 mm derin kuyu)
- Gofret gerekirse bir jilet kullanarak temizleyin. Aseton, Metanol ve IPA ile temizleyin. 30 saniye için 50 Watt plazma işlemi gerçekleştirin
- Spin SU8-100 @ 2000 rpm. Adım 1: 500 dak, 10 sn, 100 dev / s, Adım 2: 2000 rpm, 30 s, 300 devir / s].
[NOT: SU8 iplik sonra cımbız ile gofret tutmayın] - Yumuşak fırında 65 gofret ° C 20 dakika ve 95 ° C de 50 dk.
- Gofret, istenilen bir maske aracılığıyla UV ışınlarına maruz kalmaktadır. Doz 150 mikron yükseklik için 650 mJ / cm 2.
- Mesaj maruz gofret 65 ° C 1 dakika ve 95 ° C de 12 dakika pişirin.
- 15 dakika SU8 geliştirici gofret geliştirin.
Mikrokanal Yüksek Lisans Protokolü (500 mm derin kuyu)
- Gofret gerekirse bir jilet kullanarak temizleyin. Aseton, Metanol ve IPA ile temizleyin. 30 saniye için 50 Watt plazma işlemi gerçekleştirin
- Spin SU8-2150 @ 1000 rpm. Adım 1: 500 dak, 10 sn, 100 dev / s, Adım 2: 1000 rpm, 30 s, 300 devir / s].
- Yumuşak fırında 65 gofret ° C'de 15 dakika ve 95 ° C 2 saat ve 30 dakika.
- Gofret, istenilen bir maske aracılığıyla UV ışınlarına maruz kalmaktadır. 650 mikron yükseklik için maruz kalma dozu 685 mJ / cm 2 .
- Mesaj maruz gofret 65 ° C 5 dakika ve 95 ° C de 35 dakika pişirin.
- 20-30 dakika süreyle SU8 geliştirici gofret geliştirin.
PDMS çözüm hazırlığı
- Polidimetilsiloksan (PDMS) çözümü 10 parça silikon elastomer standart bir Sylgard 184 kiti 1 kısım sertleştirici iyice karıştırılarak hazırlanır.
- PDMS çözüm karıştırma işlemi sırasında oluşturulan kabarcıklar, bir vakum desikatörde kullanarak kaldırılır.
- Kabarcık PDMS çözüm yavaş SU8 yüksek lisans ve üçüncü katman için boş bir Petri kabı üzerine sürülür.
- Sıcak plaka sıcaklığı 75 ° C ve PDMS 2 saat bu sıcaklıkta kür
- Uygun boyutta delgeç kullanılarak girişleri, çıkışları ve döviz kuyu açılmıştır.
- Katmanları, bir el plazma cihazı kullanılarak bir cam slayt (büyüklüğü 0.1 mm) bir araya yapıştırılır.
B. deney düzeneği
- Mikro cihaz üzerinden akış% 70 etanol sterilize etmek. Akış DI su etanol yıkayın. Mikrokanallı duvarları olmayan insülin özel adsorpsiyon önlemek için cihaz üzerinden 50 ml% 0.5 BSA serpmek.
- Glukoz rampa degrade ve pompaları gradyanlar kararlı olduğundan emin olmak için test şırınga ile iletişim LabView yazılımı tarafından oluşturulan diğer ilgili gradiyent.
- 37 ° C de 30 dakika boyunca 5 mcM Fura-2/AM (bir kalsiyum göstergesi, Moleküler probları, CA) ve 2.5 mcM rodamin 123 (Rh123, mitokondriyal bir potansiyelleri göstergesi, Sigma, MO) 25-30 fareler adacıklar ile inkübe edildi. 2 mM glukoz içeren Krebs-Ringer tampon (KRB)
- Fareler adacıklar dikkatle giriş bağlantı noktası üzerinden mikroakışkan perifusion cihazı pipetlenir.
- Tygon tüp ve bir Y-konektör ve fraksiyon toplayıcı çıkış kullanarak şırınga pompaları için giriş bağlayarak mikroakışkan ağ kurulumu. Cihaz mikroskop (37 ° C) ısıtma aşamasında oturur ve giriş tüp, 37 oda ve çözüm sıcaklığı tutmak için bir ocak ısıtmalı ° C
- Hemen kurulumdan sonra, farelerin adacıklar KRB sonra, 10 dakika ve 25 dakika glukoz rampası (2mm 25mm) için 2 mM glukoz içeren perifused.
- Zaman atlamalı görüntüleri her 15 sn SimplePCI yazılım tarafından toplanır ve analiz edilir. Perifusate da insülin salgılanması ELISA kiti kullanılarak analiz etmek için bir fraksiyon toplayıcı kullanarak her dakika toplanır.
Temsilcisi Sonuçlar
Fare adacıklar 2-25 mM glukoz doğrusal bir degrade ile perifused. Şekil 1'de gösterildiği gibi, kalsiyum akını ve insülin salgılanması 6 mM glukoz ilgili perifusion yaklaşık 13 dakika sonra tetiklenir. Mitokondrial potansiyelleri değişiklikler, yaklaşık 11 dakika beklendiği gibi daha erken görülür. Bu veri, adacık fizyoloji karakterize etmek için bu mikroakışkan ağını kullanarak avantaj göstermektedir.
Şekil 1: Adacık hücre stimülasyonu için fizyolojik tepkiler .