Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Özet

Undecalcified kemik histolojisi, klinik ve araştırma uygulamaların çeşitliliği için önemli bilgiler sağlar. Bu teknik, özellikle büyük boyutlu örnekleri, zordur. Bu video kaliteli bölümleri üretim sürecini göstermektedir ve bunların üstesinden gelmek için hangi teknik zorluklar ve yöntemler göstermektedir.

Özet

Undecalcified kemik histolojisi kemik mikro-mimari göstermektedir. Bu mineralize kemik, kemik döngüsü ve kemik yapım ve yıkım ile ilgili önemli bilgiler sağlar ve hücresel bileşenleri gösterir. Bu, klinik ve araştırma uygulamaları çeşitli büyük bir öneme sahiptir. Çok güzel görüntüler ¹ verim ve florokrom değerlendirme ve histomorfometri ² gibi teknikler sağlar. Florokrom analizi, o bir zamanda mineralizasyon miktarı ölçümü için sağlar belirli bir zaman noktasında, kalsiyum bağlamak floresan boya enjekte edilir bir tekniktir. Histomorfometri mikroskobik düzeyde kemik nicelikleme bir süreçtir.

Undecalcified kemik histolojisi Sahne teknik özellikle büyük boyutlu örnekleri zordur. Histoloji gömülü standart parafin kullanılan bu tekniği farklılıklar gerektirir. Bu video kaliteli bölümleri üretim sürecini göstermektedir ve bunların üstesinden gelmek için hangi teknik zorluklar ve yöntemler göstermektedir. Genellikle birkaç hafta Ancak, yoğunluk ve düşük kemik geçirgenliği oldukça uzun fiksasyon ve işlem süreleri gereklidir nedeniyle diğer yumuşak dokularda benzer bir şekilde, numune hazırlama, fiksasyon ve işlenmesi ile elde edilir. Gömme metakrilat esaslı reçineler gibi kemik, benzer ya da eşit sertlik ve yoğunluk ile destekleyici bir ortam kullanılarak, ancak elde parafin infiltrasyon ve gömme aksine, bu geri dönüşü olmayan bir bir adımdır. Kesit florokrom analizi gibi çalışmalar için en uygun kalın bir bölümü, üretir öğütülmesi ile elde edilebilir. Bu iyi bir macrotome bir elmas bıçak kullanılarak elde edilir. Alternatif olarak, ince kısımların ışık mikroskobu için üretilen ve bu çok keskin bir bıçak ile bir kızak mikrotom kullanılarak elde. Kızak mikrotom büyük, sert bloklar için gerekli ek güç ve kararlılık sağlar. Reçine gömülü gösterilmektedir lekeleri çeşitli bölümleri ile boyanmış olabilir.

Protokol

1. Dokusu,% 10 fosfat içeren kapalı bir kapta tamponlu ^formalin 3 içinde yer alır . Florokrom analizi fluorochromes ışığa duyarlı olarak, olması ise, minimal ışığa maruz kalma olun.
2. Doku hangi yönlendirme gerekli olacak kurulması.
3. Numune boyutuna kesin, doğru yönde, bir grup gördüm. Emin olun güvenlik önlemleri yapıştırılır. Numune sonra opak bir kap içine konur, hacmi yeterli fiksasyon elde etmek için yaklaşık on katı numune boyutu olmalıdır. Numune boyutuna bağlı olarak bir ila iki hafta olmak üzere toplam formalin kalmalıdır. Bu kontrolü doku testi ve optimizasyonu amaçlar için kullanılmasını önerdi.
4. Doku gömme kalıp sığar doku ve% 70 etanol içeren, kapalı bir opak kap içine yerleştirin.
5. Işık ve sürekli ajitasyon altında koruyucu, etanol konsantrasyonları artan doku işleyin.
   1. % 70 etanol 1 hafta
   2. % 80 etanol 1 hafta
   3. % 90 etanol 1 hafta
   4. % 100 etanol 1 hafta
6. Daha sonra doku, ışık ve sabit ajitasyon altında tekrar koruyucu 1 hafta bütanol temizlenir.
7. Reçine ve kemik yoğunluğu yakından reçine yoğunluğu (bkz. adım 8) değiştirilebilir eşlemeli ve doğru yoğunluğu sağlamak için ilk olarak bir test örneğinin gömme tavsiye edilmelidir. Biz ışık mikroskobu ve florokrom analiz için Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) kullanın. Immünohistokimya gerekiyorsa alternatif bir reçine gibi Technovit 9100 (Heraeus Kulzer) olarak kullanılması gerekir.
8. Technovit 7100 hazırlık çözüm gerekirse, kit ile birlikte verilen yumuşatıcı çözüm küçük alikot ile karışık olabilir, ancak en fazla 5% hazırlık çözüm hacim; deneyimlerimiz yumuşama çözüm nadiren gereklidir. Mutlak etanol ve baz sıvı Technovit 7100 eşit parçaya 24 saat ışığa maruz kalma en aza indirmek için bir ön infiltrasyon çözüm olarak ve ajitasyon ile karıştırılır ve doku uygulanır.
9. Infiltrasyon çözüm sonra, 100 ml tabanı sıvı içinde çözünmüş 1 gr sertleştirici I (= 1 torba) kullanılarak yapılır. Bu ön infiltrasyon çözüm yerine sürekli ajitasyon altında 1 hafta sızmak için izin verilir.
10. Aşağı kesim yüzeyi yüz doku, kalıp içine yerleştirin. (Ideal olarak en az 5 milimetre) reçine için doku etrafında bir marj var olduğundan emin olun; bu blok gücü sağlar. 1 sertleştirici II ml Technovit 7100 hazırlık çözüm 15mls karıştırın ve kalıp numune etrafında dökün ve en az 5 millimietres kapağı. Kür 2 saat içinde başlayacaktır, ancak bir gecede tamamlanmış olacaktır.
11. Montaj Technovit 3040 (Heraeus Kulzer) kullanarak bir yedekleme blok fashioning sonra yapılır. Toz 1 kısım sıvı viskoz bir sıvı elde etmek için 2 parça bir hacim oranı 3040 Technovit karıştırın. Technovit 3040 blok blok temel üzerinde en az 2 mm bir seviyeye geri girinti içine dökün. Yaklaşık 10 dakika sonra kalıp uzak soyulmuş ve blok hazır olabilir.
12. Yoğunluğu ve bu nedenle metakrilat reçine kesme özellikleri, odadaki ortam nem duyarlı. Bloklar dolayısıyla desikatöre saklanmalıdır.
13. Zemin kesit kalınlığı 20-50 mikrometre arasında büyük bölümleri üretir. Kalın bölümlerde parlak floresan üreten (bölümüne bakınız) florokrom analizi için yararlı olur. Macrotome elmas bıçak sabitleyin. Macrotome rezervuar yağ, petrol ruhu gibi ekleyin. Güvenli ve kelepçe blok bıçak yolunuzu. İzin yeterli yağlama sağlar (Bölüm başına yaklaşık 20-30 dakika) yavaş yavaş ortaya taşlama. Ilk bölümü kesme yüzünü ortaya çıkarır ve bölümü atılmalıdır yönlendirir.
14. Bir sonraki bölümde, ardından bir SuperFrost Plus slayt yerleştirilir. Bu bölüm, bunun üzerinde bir sandviç torbası bir kısmını yerleştirerek ve daha sonra başka bir slayt yerde kelepçeli düz tutarak tavsiye ederiz kıvrılabilecek. Daha sonra 1 saat boyunca sıcaklık 60-80 derece arasında bir inkübatör içine yerleştirilir. Bu metakrilat yumuşatır ve düz bir şekilde slayt bölümünde uymak yardımcı olur.
15. Nazik bir şekilde ince kum zımpara kullanarak gerekli zemin bölümünde temizlenir ve parlatılır olabilir.
16. Kızak mikrotom, ince kesitler keser ışık microsocopy için en iyi bölümleri sağlar. Bu sabit bloklar kesim için gerekli sertliği, gibi bir kızak mikrotom kullanın. Alternatif olarak çalışan döner mikrotom kullanılabilir. Keskin bir paslanmaz çelik bıçak kullanın. Bu bir kullanılan diğer olarak bilenmiş olarak kullanılabilir iki ağza sahip olmak tercih edilir. Bıçak bloğu ile 45 derecelik bir açı yapmalıdır. Surface yumuşatma gerekirse engellemek için ıslak bir kağıt uygulayarak elde edilebilir. Bu kaliteli bir bölümünü elde etmek için istenilen kesme koşulları elde etmek için çeşitli bölümler sürebilir. Bu bölüm, daha sonra bir su banyosu üzerinde yüzen ve 16 olduğu gibi bir slayt yerleştirilir.
17. Boyama reaktifler, aşağıda Malzeme listelenmiştir. Protokoller, ^Bancroft 4 ve ark . Kalınlık değişimi nedeniyle test slaytlar üzerinde lekeler optimize etmek için tavsiye edilir. Raf boyama doku gerekebilir doğrudan düz bir slayt lekeleri ekleyerek böylece slayt float neden olabilir. Özdeş bir protokol ya da raf boyama histomorfometri için gerekli tutarlı boyama sonuçlar için gereklidir.
    1. Hematoksilen ve Eosin
       1. Haematoxyilin 5-10 dakika ile Leke
       2. Scott, musluk suyu ile yıkayın
       3. Eozin 5 dakika ile Leke
       4. Musluk suyunda yıkayın
       5. Ksilen içinde Temizle
       6. Dağı
       7. Sonuçlar
          1. Osteoid = Pembe
          2. Kalsifiye kemik = morumsu kahverengi
          3. Çekirdekler = mavi
    2. Von Kossa
       1. Gümüş nitrat çözeltisi koyun ve güçlü ışığa maruz mineralize kemik siyah olana kadar (yaklaşık 10 dakika)
       2. Üç kez distile su ile yıkayın
       3. 5 dakika boyunca sodyum tiyosülfat ile Tehdit
       4. Distile su ile yıkayın
       5. Safrinin O ile Counterstain
       6. Ksilen içinde Temizle
       7. Dağı
       8. Sonuçlar
          1. Mineralised kemik = black
          2. Osteoid = kırmızı / pembe
    3. Masson Goldner s trikrom
       1. (% 80 etanol 90mls ve 20 dakika boyunca% 25 oranında amonyak 10mls) alkalin alkol ile yıkayın.
       2. Suyla yıkayın
       3. Distile su ile durulayın
       4. 10 dakika boyunca Weigert s Hematoksilen ile Leke
       5. Distile su ile durulayın
       6. Ponceau-Fuchsin nihai çözüm 5 dakika ile Leke
       7. % 1 asetik asit ile 15 saniye çalkalayın
       8. Phosphomolybdic asit-turuncu G çözüm 5 dakika içinde Leke
       9. % 1 asetik asit ile 15 saniye çalkalayın
       10. 5 dakika açık yeşil ile Leke
       11. % 1 asetik asit ile durulayın 3 değişiklik
       12. Distile su ile durulayın
       13. Dağı
       14. Sonuçlar
           1. Mineralised kemik = yeşil
           2. Osteoid = kırmızı / turuncu
           3. Çekirdekler = mavi gri
           4. Kıkırdak = mor
18. Florokrom hazırlıkları:
19. Bunlar en az iki hafta arayla, yavaş intravenöz enjeksiyonu ile idare edilmektedir.
20. Dozlar
    1. Calcein Yeşil 10 mg / kg IV
    2. Oksitetrasiklin 50 mg / kg IV
    3. Alizarin Complexone 30 mg / kg IV
21. Calcein Yeşil hazırlanması
    1. Calcein Yeşil Bir gram eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edilir.
    2. pH pH = 7,1-7,2 kadar% 1 NaOH ile ayarlanır.
    3. Filtre ve ışıktan korumalı tutmak
22. Alizarin Complexone hazırlanması
    1. Üç gram Alizarin complexone eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edilir.
    2. pH pH = 7,1-7,2 kadar% 1 HCl veya NaOH ile ayarlanır.
    3. Filtre ve ışıktan korumalı tutmak
23. Oksitetrasiklin, hazırlanması
    1. Oksitetrasiklin raftan bir anti-mikrobik ilaç olarak kullanılabilir. Herhangi bir hazırlama gerekli değildir.

Malzemeler

a) Hemotoxylin çözüm
Hemotoxylin	1g
Saf alkol	100 mL
b) Demir Çözüm
% 30 sulu demir klorür	4ml
Hidroklorik asit (konsantre)	1mL
distile su	95mL

a) Ponceau de xylidine çözüm
Ponceau de xylidine	0.75g
asit fuchsion	0.25g
Asetik asit	1mL
mix ve distile su (100 ml)
b) azophloxin çözüm
Azophloxin	0.5g
Asetik asit	0.6mL
mix ve distile su (100 ml)
c) Final çalışma leke çözüm
Ponceau-fuksin çözüm	5-10ml
Azophloxin	2mL
% 0.2 asetik asit çözeltisi	88mL

Açık Yeşil	1g
asetik asit	1mL
Mix ve distile su (500ml)

Phosphomolybdic asit	3g
Turuncu G	2g
500ml distile su içinde çözülür ve kristal timol ekleyin.

% 1 sulu gümüş nitrat

% 2,5 sodyum tiyosülfat

% 1 safranin O

Alsiyan mavi 8GX	1g
% 3 asetik asit çözeltisi	100 mL

a) Harris hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
Saf alkol	25ml
Potasyum Şap	50g
distile su	500ml
cıva oksit	1.25g VEYA
Sodyum iyodat	0.5g
Asetik sirke asidi	20ml
b) Eozin çözüm
Ticari olarak üretilen Eozin kullanılmıştır.

Üretici	Florokrom	Katalog Numarası
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcein Yeşil	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarin Complexone	A3882
Intervet Avustralya, Victoria	Oksitetrasiklin (Raf antimikrobiyal ilaç kapalı)	Unvanı; Engemycin 100