Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Commissural nöronların yaygın, embriyonik omurilik gelişim sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Bu nöronların hücre gövdeleri dorsal omurilik bulunur ve aksonlar embriyonik gelişim sırasında kalıplaşmış yörüngeleri takip. Commissural aksonlar ilk Taban doğru ventral proje. Orta hatta geçtikten sonra, bu aksonlar, beyin tarafına doğru anteriora ve proje çevirin. Bu adımların her biri birkaç rehberlik ipuçlarının eylem tarafından düzenlenir. Commissural nöronlar yüksek oranda zenginleştirilmiş Kültürler ideal dönüm deneyleri, immünokimyanın ve biyokimya da dahil olmak üzere, akson yol bulma mekanizmaları, birçok deneyler için uygundur. Burada, E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, omurilik, izole edilir ve dorsal şeritler disseke vardır. Dorsal doku trypsinization ve mekanik bozulması hücre süspansiyonu sonra ayrışmış. Nöronlar, poli-L-lizin kaplı cam lamelleri veya doku kültürü yemekleri üzerine kaplanmıştır. 30 saat sonra
Protokol
1. Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu
Genel öneriler
L-15 orta boy buz üzerinde tutun ve sık sık diseksiyonu çanak orta embriyoların serin tutmak için. Bu doku bütünlüğünü korumaya yardımcı olur. Belirtilmediği sürece tüm adımları Dumont # 5 forseps iki çift ile yapılır. Kontaminasyonu engellemek için,% 70 etanol ile tüm araçlar ve çalışma yüzeylerinde sprey ve diseksiyon orta şişe kapalı tutmak. Yemekler arasında embriyolar transfer etmek için, bir kesim plastik pipet veya delikli bir kaşık kullanın. Diseksiyonu başarıyla tamamlamak için omurilik (germe, nick) zarar görmemesi için kritik öneme sahipti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz embriyonik sıçan omurilik commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem tanımlanmıştır. Bu prosedür, laboratuvarda rutin olarak güvenilir bir akson rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışma nöronların hazırlamak için kullanılır olmuştur. Hücre biyolojisi ve immünokimyanın deneyler, bir çöp diseksiyonu için yeterli nöron üretir. Daha fazla hücreler ihtiyaç olduğunda, birçok biyokimya deneyler, iki litre diseksiyonu gibi gerekli olabilir. Eğitimli bir kişi için, teşrih ve ~ 20 embriyoların ayrılma.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR), Peter Lougheed Tıbbi Araştırma Vakfı, Neuroengineering McGill Programının hibeleri ile desteklenen, Viyana de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Yenilik Kanada Vakfı (CFI .) Viyana Master Eğitim Ödülü Sébastien D. Langlois tarafından desteklenen de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri Frederick Banting ve Charles tarafından En İyi Kanada Lisansüstü Bursları Master Ödülü. Biz rakamları ile yardım için Jessica MT Pham müteşekkiriz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu (Tablo ayrıca görüyorum)
- E13 sıçan gebelik aşamalı
- Etanol 70%
- Cerrahi makas, Güzel Bilim Araçları
- Forseps, Dumont # 5 Güzel Bilim Araçları
- Petri kutularına
- L-15 orta
- Diseksiyon mikroskobu, Leica
- Plastik transferi pipetler
- Microscissors, Güzel Bilim Araçları
- Tungsten iğne ve pim sahipleri (kanca şeklinde bir iğne, bir L-şekilleri iğne, bir düz iğne), İnce Bilim Araçları
- Isı ile inaktive At Serum (HiHS)
- 15 ml plastik tüpler
Commissural nöron kültürü (Tablo ayrıca bkz.)
- Doku kültürü inkübatörler (37 ° C,% 5 CO 2, nem kontrollü)
- Alman Desag lamelleri cam ve / veya plastik doku kültürü yemekleri
- Poli-L-lizin, Sigma
- Steril milliQ H 2 O
- Neurobasal, Invitrogen
- Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penisilin / Streptomisin antibiyotik
- 37 ° C su banyosunda
- Steril Pasteur Pipetler
- Bunsen gaz yazıcı
- HBSS, Ca 2 + Mg / 2 + ücretsiz, Invitrogen
- DNAz, Worthington
- MgSO 4
- Santrifüj
- Hemasitometre
- Tripan Mavi Çözümü
Kaynaklar
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
