Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41) mevcut M. magneticum AMB-1.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41
Bu makalede
Özet
Özet
Magnetotactic bakteri jeomanyetik alanlar boyunca kendi yolunuzu mümkün Sudaki mikroorganizmaların çeşitli bir grup oluşturmaktadır. Bu davranış uygun ortamlar için arama yardımcı olduğuna inanılıyor
Protokol
1. E. Mama Gen Klonlama ve İfade coli
5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 've 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3' mutant gen mamAΔ41 primerler Magnetospirillum magneticum AMB-1 genomik DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi. Çoğaltılan DNA parçaları, bir NcoI sitesinde başlatma kodon ATG sunuldu ve fesih kodon bir ScoI site ile değiştirilir. Parçaları NcoI ve Sacl ile sindirilir ve pET52b ilgili siteler (+) klonlanmış pET52bMamAΔ41-AMB1 sebebiyet veren. Bu yapı, mamAΔ41 gen-C-terminalindeki 10-tag ile çerçeve içinde erimiş oldu. Plazmid, E. coli suşu BL21 içine electroporated old....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Proteinlerin saflaştırılması, herhangi bir biyokimyasal proteinler ya da yapısal çalışmalar içinde önemli bir adımdır. Her protein kendi davranışları ile benzersiz olduğu için, onun özelliklerini tanımlamak ve buna göre arıtma değiştirmek gerekiyor. Protein hedef biyoinformatik araçlar kullanarak arıtma doğru bir ilk adım olarak analiz edilmelidir. Onlar, hedef iso-elektrik nokta hesaplamak için çevre ve özel iyonları / ligandlar için ihtiyacı azaltıcı / oksitleyici ihtiyacı değerlendirmek için kullanılır. Protokol hede.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Biz, onların tavsiyelerini ve yorumlar için verdiği destek ve Geula Davidov, Noam Grimberg ve Chen Guttman Dr. Amir Aharoni kabul etmiş sayılırsınız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Ekipman | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| Basınç hücresi | Ekipman | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| Ultra-santrifüj | Ekipman | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| Rotor | Ekipman | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| Ultra-santrifüj tüpleri; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Ekipman | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| 2.5cm çapında, Cam Econo-Kolon Kromatografi Kolonları | Ekipman | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind reçinesi | Ekipman | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| Spektrofotometre | Ekipman | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| Kuvars küvet | Ekipman | Hellma | 104-QS | |
| Hızlı Sıvı Kromatografisi- AKTA purifier 10 | Ekipman | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| İyon değişim kolonu – MonoQ 4.6/100 PE | Ekipman | GE Healthcare | 10025543 | |
| Boyut dışlama ön doldurulmuş kolonu-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Ekipman | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Ekipman | Sartorius AG | VS1501 | |
| Masaüstü santrifüj | Ekipman | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Ekipman | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hidroksimetil) aminometan | Reaktif | BioLab | 20092391 | |
| Sodyum Klorür | Reaktif | FRUTROM | 235553470 | |
| İmidazol | Reaktif | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri kokteyli | Reaktif | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnase I (Deoksiribonükleaz I) | Reaktif | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Sığır Trombini | Reaktif | Fisher Scientific | BP25432 | |
| Glisin | Reaktif | BioLab | 07132391 | |
| Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) | Reaktif | BioLab | 19822391 | |
| Beta-merkapto–etanol | Reaktif | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | Reaktif | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Ön Boyalı Protein Merdiveni | Reaktif | Fermentas | SM0671 |
Kaynaklar
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D'Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
