Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Özet

Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz - anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.

Özet

Anjiyogenez anjiyogenik uyaranlara yanıt olarak, yeni damarlar mevcut damarsal oluşturulan karmaşık çoklu adımlı bir süreçtir. Bu adımlar şunlardır: ekstrasellüler matriks, kablosuna AT uyum içine endotel hücreleri bazal membran, proliferasyon ve göç (çimlenme) (EC) bozulması, dallanma, lümen oluşumu, anastomoz, ve yeni bir bazal membran oluşumu. In vitro tayinlerde, bu süreç pek çok çalışma için geliştirilmiş, ancak çoğu sadece belirli aşamalarında anjiyogenez taklit ve morfolojik testlerin içinde gemilerin çoğu in vivo gemileri benzemez edilmiştir. Nehls ve Drenckhahn tarafından daha önceki çalışmaları üzerine dayanarak, insan umbilikal ven EC ve fibroblastlar kullanır in vitro anjiyogenez tayininde bir iyimserlik var. Bu model özetlediği anjiyogenez en önemli erken aşamalarında ve daha da önemlisi, gemilerin polarize Avrupa Komisyonu tarafından çevrili patent hücrelerarası lümen gösterilecek. EC cytodex microcarriers üzerine kaplanmış ve fibrin jel içine gömülü. Fibroblastlar EC boncuk yüzeyinden çimlenme teşvik gerekli çözünür faktörlerin sağlayan jel üstünde katmanlı. Birkaç gün sonra, çok sayıda gemiler, faz-kontrast ve zaman atlamalı mikroskobu altında kolayca gözlenebilir olduğunu mevcut. Bu video bu kültürlerin kurulmasında önemli adımlar gösteriyor.

Protokol

HAZIRLAMA HÜCRELERİ

1. FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 gün boncuk önce M199/10% HUVEC ve fibroblastlar getirin.
2. Fibroblastlar için gömmeden önce HUVEC ve gün için boncuk önce EGM-2 (Clonetics) gün orta açın.
3. ~ 400 HUVEC başına boncuk bir konsantrasyon gereklidir.
4. Ortalama 20.000 fibroblastlar ihtiyaç vardır.

HUVEC İLE BONCUK KAPLAMA - GÜN -1

1. HUVEC Trypsinize.
2. Boncuk (SANTRİFÜJ VERMEYİN!) Yerleşmek için izin ver. Süpernatantı aspire ve 1 ml sıcak EGM-2 orta boy boncuklar kısaca yıkayın.
3. FACS tüp sıcak EGM-2 orta boy 1.5 mL Mix 2500 boncuk w / 1x10 ⁶ HUVEC. Inkübatör dikey olarak yerleştirin. (Gerekirse ~ 10 kuyu. Ölçeği için yeterli olacaktır)
4. Tüp sallayarak her 20 dakikada, 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. (İyi kaplama filizlenmesi için çok önemlidir.)
5. 4 saat sonra, T25 EGM-2, 5 ml'lik bir balona kaplı boncuklar transfer ve O / N terk

Fibrin GEL 'IN KAPLI BONCUK Katıştırma GÜN 0 -

1. 2.0 mg / ml fibrinojen solüsyonu (tarifi bölümüne bakınız) hazırlayın.
2. 0.15 Birimler / ml aprotinin fibrinojen solüsyonu ekleyin.
3. 15 mL konik bir tüp kaplı boncuk boncuk transferi ve yerleşmek. EGM-2 1 ml ve 1.5mL bir santrifüj tüpüne transfer süspanse edin boncuk.
4. YAVAŞÇA yukarı ve aşağı pipeting EGM-2 1mL 3X boncuk yıkayın.
5. Bir lamel tespih ve ~ 500 boncuk / ml 'lik bir konsantrasyon fibrinojen solüsyonu tekrar süspansiyon haline getirin.
6. Her bir kuyu için 0.625 ünite / ml trombin ekleyin.
7. 24 plaka her bir kuyu için 0.5 mL fibrinojen / boncuk süspansiyonu ekleyin.
   
   Her bir kuyu için pipet !
   
   
8. Trombin ve fibrinojen pipet ucu ile yaklaşık 4 - 5 kez yavaşça aşağı yukarı gidiyor ve karıştırın. Büyük baloncuklar yapmak için dikkatli olun.
9. Kaputu 5 dakika plaka bırakın, sonra bir pıhtı oluşturmak için 10-15 dakika süreyle 37 ° C-inkübatör yerleştirin.
10. Pıhtı beklerken, fibroblastlar trypsinize.
11. 1 EGM-2 mL başına damla damla ekleyin.
12. Ortalama 20.000 hücre bir konsantrasyon fibrin jel üstünde Tohum fibroblastlar.

NOTLAR:

Genellikle, fibrin jel oluşur, jel küçük kabarcıklar göreceksiniz. Merak etmeyin, bunlar 3-4 gün içinde kaybolur.

, Her gün, yani Gün 2, 4, 6, vb ortam ..

Günde 3 veya 4 ile çimlenme başlamalıdır.

Tartışma

, In vitro anjiyogenez deneylerde üç boyutlu (3D) 2D kültürleri kullanılarak elde edilebilir in vivo daha gerçek bir ortamda daha yakın bir model sunuyoruz artan bir fikir birliği yoktur. Bu üstün 3D sistemleri tekrarlanabilir ve anjiyogenez önemli adımlar birkaç taklit etmek mümkün gerektiği açıktır. Önceki birkaç 3D testleri geliştirilmiş olsa da, bunların pek çoğu ya mikrovasküler hücreleri elde etmek için zor kullanmak, ya da sadece bazı aşamaları özetlemek. Bu video, açıklamak ve vasküler araştırma ve kolayca elde edilebilen ve en sık ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cytodex-3 Boncukları	Reaktif	Amersham	17-0485-01	10 g/şişe. 1.0.5 g kuru boncuk, 50 mL PBS (pH = 7.4) içinde en az 3 saat oda sıcaklığında hidrate edilir ve şişirilir. 50 mL'lik bir tüp kullanın ve tüpü sarsıcıya yerleştirin.2.Boncukların çökelmesini bekleyin (~ 15 dk). Süpernatantı atın ve boncukları taze PBS (50 mL) içinde birkaç dakika yıkayın.3.PBS'yi atın ve taze PBS ile değiştirin: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 boncuk/mL veya 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 boncuk/mL4.Boncuk süspansiyonunu silikonize edilmiş bir cam şişeye (Windshield Wiper veya Sigmacote) yerleştirin.5.Boncukları 115°C'de 15 dk otoklavlayarak sterilize edin.6. 4°C'de saklayın.
Aprotinin	Reaktif	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/şişe. Liyofilize aprotinini DI su içinde 4 U/mL konsantrasyonda yeniden çözün. Steril filtreleyin. Her biri 1 mL olan alikotlar hazırlayın. -20 °C'de saklayın.
Fibrinojen Tip I	Reaktif	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. 2 mg/mL fibrinojeni DPBS içinde çözün. Pıhtılaşabilir protein % değerini not edin ve buna göre ayarlayın. Fibrinojeni çözmek için 37 °C'lik su banyosunda ısıtın. Tüpü altüst ederek karıştırın. Vortekslemeyin. 0.22 µm filtreden geçirerek sterilize edin.
Trombin	Reaktif	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1,000 ünite. Steril su içinde 50 U/mL konsantrasyonda yeniden çözün. Her biri 0.5 mL olan alikotlar hazırlayın. -20 °C'de saklayın.