Yöntem makalesi

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

DOI:

10.3791/1935

⸱

13 Haziran 2010

 ,  ,  , 
1Department of Physical Electronics, Faculty of Engineering, Tel Aviv University, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, University of Illinois, 4Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi hızla DNA molekülleri ve proteinler gibi biyolojik testleri, hassas ve kolayca tespit etmek için kullanılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir manyetik modülasyon biyoalgı sistemi (MMB) [1,2] hızlı ve homojen olarak herhangi bir yıkama veya ayrılık adım olmadan düşük konsantrasyonlarda tespit biyolojik hedefler. IL-8 hedefi varsa, 'sandwich' tabanlı test, IL-8 hedef ve bir biotinlenmiş IL-8 antikor ile birleştiğinde flüoresan protein streptavidin, IL-8 yakalama antikor manyetik boncuk bağlı. Manyetik boncuklar iki elektromanyetik kutubdan alternatif manyetik alanın gradyanı uygulayarak salınım hareketi içine manevra. Manyetik boncuk bağlı olan floresan proteinleri, dik bir lazer ışını senkron algılama kullanarak demodüle periyodik bir floresan sinyal üretir ve algılama alanı ve hareket içine yoğunlaşmış. Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi, yapısal olmayan Ibaraki virüs protein 3 (ns3), tamamlayıcı DNA (cDNA) [2] kodlama dizileri önceden tespit etmek için kullanılır oldu. Parçacıklar dış manipülasyon ve yoğunlaşma Bu çalışmada gösterilmiştir teknikleri diğer uygulamalar, örneğin manyetik çiftli ilaçlar teslimat için kullanılan olabilir

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IL-8 tahlil:

  1. Reaksiyon karışımı kendi konsantrasyonları tahlil tampon 100 ul son hacmi aşağıdaki dört bileşenden dahildir. 10, 100 boncuk / ml nihai konsantrasyonları, 1 nano-gram/μl final konsantrasyon biotinlenmiş IL-8 antikor 2 ul, 20 nano-gram/μl final konsantrasyon streptavidin floresan protein 1 ul, yakalama antikor manyetik boncuk ul ve 1, IL-8 hedefin 0.48 pico-gram/μl ul. Bileşenler tek tek tahlil tamponu eklenir ve sonra 30 dakika boyunca sarsıldı.
  2. Bir kontrol reaksiyonu IL-8 hedef olmadan aynı şekilde hazırlanır.
  3. Tepkiler, daha sonra, herhangi bir ayrılık ya da yıkama küvetleri olmaksızın yerleştirilir ve MMB sistemi ile kontrol edilmektedir.

MMB sistemi:

  1. Elektromanyetik iki kutup arasındaki yerini küvet yerleştirin.
  2. Modülasyon akımı çalıştırın ve boncuk agregasyonu ve yoğunlaşma izin vermek için 30 saniye bekleyin
  3. Sinyal kilit amplifikatör bir osiloskop kullanarak ölçün.

Temsilcisi Sonuçlar:

Toplu boncuk Görsel inceleme hedef ve hedef olmadan reaksiyon ile tepki arasında belirgin bir fark sundu. Hedefi ile tüm reaksiyonlarda, boncuk, birleşin şekilde lazer ışını ve dışarı taşındı, tek bir yoğun agrega kurdu. Ancak, hedef olmadan tepki olarak, boncuk daha az toplu ve hareket (bkz. Şekil 1) daha az birleştirmek oldu.

Şekil 1
Şekil 1: (a) hedef olmadan sandviç 'immunoassay görsel denetim IL-8, IL-8 ile hedef (b) .

Kutuplu modülasyon saat (sarı) ve PMT çıkış sinyali (kırmızı) 0,48 gram pico-IL-8 hedef tespit ederken, (a) Şekil 1'de sunulmaktadır. Her kutup için modülasyon frekansı 2 Hz. Ancak, teorik olarak beklendiği gibi, boncuk, lazer ışını geçerken, PMT floresan ışığı algılar ve PMT çıkış voltajı bir tepe var. Bu nedenle, demodülasyon frekansı 4 Hz. PMT sinyal ve iki katına modülasyon saat (4 Hz'de) amplifikatör kilit beslenir, hassas faz dedektörü, senkronizasyon ve yüksek gerilim (bkz. Şekil 2) sonuçları algılar.

Şekil 2
Şekil 2: (a) modülasyon saat (sarı) ve PMT sinyali (kırmızı) algılama 0.48 gram pico-IL-8 hedef. (B), iki farklı taramaları amplifikatör voltaj sonuçlandı kilit.

Amplifikatör kilit kontrol örneği test edildi herhangi bir sinyal tespit etmedi. Bu durum, MMB sistemi agregasyonunda görsel fark ile birlikte IL-8 hedefin varlığı açıkça tespit düşündürmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özetle, biz MMB sistemi düşük konsantrasyonlarda (0.5 pico-gram [3,4] Bio-Plex Precision Pro sitokin testlerin saptama sınırı), IL-8 hedefin varlığını tespit etmek için kullanılabileceğini gösterdi. Sisteminin yeteneği IL-8 ile sınırlı değildir ve diğer proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. MMB sistemin avantajları, hızlı bir şekilde ve herhangi bir ayrılık ya da yıkama adım olmadan hedef tespit etmeye yeteneği. Bu nedenle, algılama süreci kolaylaştırır ve sistem alanında uygulamalarda kullanılmasına izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ishaya Horowitz Fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bio-Plex Pro İnsan Sitokin IL-8 setiBio-Rad171-B5008M
Rekombinan insan IL-8 hedefiThermo Fisher Scientific, Inc.R202625
Biyotinli monoklonal fare anti-insan IL-8 antikoru G265-8BD Biosciences554718
Streptavidin bağlı floresan proteinBio-RadStreptavidin PE

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Manyetik BoncuklarIL 8 TespitiFloresan ProteinlerAlternatif Manyetik AlanLock in Amplifikat rSenkron Alg lamaLazer Uyarmas

İlgili makaleler