Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Özet

Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.

Özet

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer

Protokol

Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama

1. Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir.
2. Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj.
3. Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya - (Mg ² olmadan ⁺ ve Ca ^{2 +)} ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır.
4. Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya onlara 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 ml% 4 paraformaldehid (PFA) tarafından sabitlenir.
5. Hücreler iki kez 1ml PBS tekrar yıkanır.
6. Yıkama, blok hücreleri sonra yeniden askıya Blok Çözüm 1 ml (% 6 serum/94% PBS). 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
7. 200 gr az 4 dakika sonra, tüpler santrifüj ve Blok Çözüm aspirat. Primer antikor çözeltisi (Blok Çözüm tavsiye seyreltme ile yapılan) 1ml hücreleri yeniden askıya. Hücreler ya 1 saat veya 4 ° C'de bir gece bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında inkübe edilebilir.
8. Hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez yıkanır.
9. Sekonder antikoru çözümü (tavsiye edilen seyreltme Blok Çözüm ile yapılan) ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe 1mL hücreleri yeniden askıya sonra.
10. 1 saat sonra, hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez tekrar yıkanmış olmalıdır.
11. Blok Çözüm ile yıkadıktan sonra, 1 ml PBS ile tekrar hücreleri yıkayın.
12. Çeşitli yıkar sonra, 1 ml hücrelerin yeniden askıya DAPI nükleer leke (PBS içinde DAPI 1:10,000 seyreltme -) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
13. 5 dakika sonra, 4 dakika için 200 gr tüpler santrifüj. - 1 ml PBS DAPI nükleer leke çözüm ve yeniden askıya hücreleri aspire.

HPSCs Incorporation Bölüm 2: sitospin aparatı sayesinde üretilen slaytlar

1. Plastik slaytlar, bir matkap basın delik istenilen miktarda yaparak hazırlanıyor. Kullanılmak üzere geniş çaplı mikropipet ucu (ler) den en fazla 1 mm daha geniş çaplı olması gerekir.
2. Filtre kağıdı, makas ile plastik slayt parametreleri kesilir.
3. Delik sonra filtre kağıdı yapılır. Deliğin boyutu (ler) mikropipet ucu (ler) aracılığıyla snuggly oturduğundan emin yeterince büyük olmalıdır.
4. Sonra, hazırlanan plastik slaytlar bir üst ve alt kesilmiş filtre kağıdı (Şekil 1) yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Katmanları bant ile sabitlenir.
5. Bölüm 1 lekeli hücre süspansiyonu 100μL maksimum (istenilen tek tabaka yoğunluğuna bağlı olarak) daha sonra mikropipet ucu (lar) üstüne yerleştirilir.
6. Gerekirse, cihazı hücre çözümü ile tartılır ve benzer ağırlıkta bir karşı denge oluşturulmuş.
7. Sitospin aparatı ve dengelemek sonra bir masaüstü santrifüj yerleştirilir ve 200g 4 dakika santrifüj yapabilirsiniz.
8. Santrifüj sonra, sitospin aparat dikkatle cam slayt hücreler yerinden doesnt bir şekilde demonte.
9. Gerekirse, aşırı çevreleyen PBS - cam tarafında aspire.
10. Hücreler daha sonra istediğiniz hücreye tek tabaka elde edilip edilmediğini kontrol etmek için bir floresan mikroskop kullanılarak görülebilir.

Bölüm 3: Montaj slaytlar

1. Bir damla istenen montaj medya hücreleri içeren her bölgenin merkezinde yer almaktadır.
2. Sonra, mümkünse hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz Slaytlarınıza bir kapak kayma yavaşça indirilir.
3. Aşırı montaj medya sonra slayt kaldırılır.
4. Sonra, kapak fişleri iki tırnak cilası ile mühürlenir.
5. Slaytlar sonuçları gözlemlenen ve belgelenen kadar karanlık bir depolama alanı saklanabilir.

Tartışma

Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşulları kök hücre kültürleri büyüyen kull...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Yeniden kullanılan plastik lamlar için materyal
Önceden Temizlenmiş Superfrost/Plus Mikroskop Lamları	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filtreli Pipet Uçları	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Mikroskop Lamel Camı	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Kapatma Ortamı
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Keçi Serumu	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoklonal Antikor	EMD Millipore	MAB4304	SSEA-4 boyaması için primer antikor
Rat Anti-SSEA-3 Monoklonal Antikor	EMD Millipore	MAB4303	SSEA-3 boyaması için primer antikor
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	SSEA-4 boyaması için sekonder antikor
Alexa Fluor 488 Etiketli Keçi Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	SSEA-3 boyaması için sekonder antikor
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298