Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme

Termit tam-bağırsak DNA ekstraksiyonu için Usul özeti:

1. Chill termitler, buz üzerinde steril cımbız kullanarak gut kaldırmak ve tampon bağırsak örnekleri stabilize.
2. PVPP / SDS / fenol tampon numune homojenize.
3. Qiagen DNeasy sütunlarını kullanarak ham lizat DNA Özü ve arındırmak.

Protokol:

1. Buz, steril forseps kullanarak işçi kast termitler cesareti çıkarın.
2. 50 mcL buz 1x moleküler biyoloji sınıf TE tampon içeren steril, nükleaz içermeyen tüp hemen cesareti ve içeriğini transfer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). -20 ° C'de örnekleri Dondurma, ya da doğrudan homojenizasyon ile devam edin.
3. Transfer bağırsak örnekleri ve tampon steril, nükleaz içermeyen 2 ml vidalı kapaklı tüp, 500 mg ile% 1 w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP içeren steril zirkon / silis boncuk (0.1 mm) ve 700 ul 1x TE tampon önceden yüklenmiş .)
4. 50 ul% 20 Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 500 ul örnekleri fenol ekleyin.
5. 30 sn homojenizasyon üç kür ve buz üzerinde tüyler ürpertici 30 saniye ile en yüksek ayarı (boncuk yendi) karıştırılır.
6. 1 dakika için 8.000 x g Tortu çözünmez malzeme.
7. Ham lizat arıtma için açıklanan yöntemi kullanarak Qiagen DNeasy sütunları ile sulu (üst) tabakasının 300-ul alikotları arındırın.
8. Daha sonra kullanmak için -20 ° C'de nükleik asit içeriği ve dondurma örnekleri sayısal olarak.

In our experience, DNA extracted from the microbial communities of wood-feeding termite species like Zootermopis nevadensis is sufficiently pure for PCR template after one round of extraction and purification. However, some termites such as litter-feeding and soil-feeding species may have a higher concentration of humic acids in their gut contents and may require additional purification of gut microbial DNA. The total DNA yield from the guts of 5 Z. nevadensis workers is in the range of 10-30 μg. For termite species significantly smaller or larger than this species, more or fewer specimens may be needed to obtain a similar amount of DNA.

This method can easily be adapted to allow RNA extraction. For RNA extraction, substitute 1x RNAprotect Bacteria reagent from Qiagen (catlog no. 76506) for the ice-cold TE buffer described in step 2 of the protocol. Qiagen RNeasy reagents and columns (catlog no. 74104) should be used in place of the DNeasy purification procedure described above. As DNA can be purified from RNAprotect-stabilized samples and only 300 μL of the approx. 700 μL aqueous layer retrieved in step 7 is required for nucleic acid purification, this method can be used to retrieve both DNA and RNA in parallel from a single sample.

These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment. The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Moré et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi & Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).