Bu video termit hindgut ikamet mikropların türünün DNA ayıklamak için teknik göstermektedir. Bağırsak mikrobiyal topluluk görüntülenmesi için yararlı bir ıslak montaj kaydırağı, hazırlık da gösterilmiştir ve türler açısından zengin bir bağırsak ortamı üzerinden bir tur verilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
Termitler sadece alıcı ahşap geçinmeye kapasitesine sahip olduğu bilinen en az sayıda hayvan arasında yer almaktadır. Termit bağırsak yolu, ağırlıklı olarak asetat lignoselüloz bozulması yardımcı, yoğun ve türler zengin bir mikrobiyal nüfusun bulunduğu, termit metabolizma alevlendiren kilit besin (Odelson & Breznak, 1983). ("Düşük") bazı termitler de ökaryotik protozoa, bakteri, metan arkelerin ve bu mikrobik popülasyonları içinde. Böylece, termitler mükemmel araştırma konuları mikrobiyal türler ve ev sahibi yararına yapmak birçok biyokimyasal fonksiyonları arasındaki etkileşimleri çalışmak için. Termit bağırsaklar gibi çeşitli biyokimyasal süreçlerde yer alan anahtar genlerin mikrobiyal popülasyonların tür bileşimi, moleküler teknikler kullanılarak (Schmit-Wagner ve ark, 2003; Salmassi & Leadbetter, 2003 Kudo ve ark, 1998) incelenmiştir. Bu teknikler, termit bağırsak ortamından yüksek kalitede nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırma bağlıdır. Berthelet ve ark, 1996; Purdy ve ark, 1996; Salmassi & Leadbetter Bu video açıklanan çıkarma tekniği çevre örnekleri (Mor ve ark, 1994 nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için geliştirilen protokoller değiştirilmiş bir derleme 2003;. Ottesen ve ark 2006) ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için şablon olarak kullanmak için uygun termit hindgut malzeme üretir.
Protokol
Termit tam-bağırsak DNA ekstraksiyonu için Usul özeti:
- Chill termitler, buz üzerinde steril cımbız kullanarak gut kaldırmak ve tampon bağırsak örnekleri stabilize.
- PVPP / SDS / fenol tampon numune homojenize.
- Qiagen DNeasy sütunlarını kullanarak ham lizat DNA Özü ve arındırmak.
Protokol:
- Buz, steril forseps kullanarak işçi kast termitler cesareti çıkarın.
- 50 mcL buz 1x moleküler biyoloji sınıf TE tampon içeren steril, nükleaz içermeyen tüp hemen cesareti ve içeriğini transfer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). -20 ° C'de örnekleri Dondurma, ya da doğrudan homojenizasyon ile devam edin.
- Transfer bağırsak örnekleri ve tampon steril, nükleaz içermeyen 2 ml vidalı kapaklı tüp, 500 mg ile% 1 w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP içeren steril zirkon / silis boncuk (0.1 mm) ve 700 ul 1x TE tampon önceden yüklenmiş .)
- 50 ul% 20 Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 500 ul örnekleri fenol ekleyin.
- 30 sn homojenizasyon üç kür ve buz üzerinde tüyler ürpertici 30 saniye ile en yüksek ayarı (boncuk yendi) karıştırılır.
- 1 dakika için 8.000 x g Tortu çözünmez malzeme.
- Ham lizat arıtma için açıklanan yöntemi kullanarak Qiagen DNeasy sütunları ile sulu (üst) tabakasının 300-ul alikotları arındırın.
- Daha sonra kullanmak için -20 ° C'de nükleik asit içeriği ve dondurma örnekleri sayısal olarak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bizim tecrübelerimize göre, Zootermopis nevadensis gibi ahşap besleme termit türlerinin mikrobiyal topluluklar çıkarılan DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma bir turdan sonra, PCR şablon için yeterince saf. Ancak, çöp besleme ve toprak besleme türleri gibi bazı termitler, bağırsak içeriği hümik asit daha yüksek bir konsantrasyon ve bağırsak mikrobiyal DNA ek arıtma gerekebilir. Toplam 5 Z. nevadensis işçilerin cesareti DNA verimi 10-30 mikrogram aralığında. Önemli ölçüde daha küçük veya daha büyük bu türün termit türleri için, daha fazla veya d...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/fenol | Tampon | homojenizasyon tamponu | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Kaba lizatlardan genomik DNA izolasyonu protokolüne göre kullanılmıştır (Ek H, ürün kılavuzu versiyonu: Temmuz 2003) |
| TE | Tampon | Sigma-Aldrich | T9285 | 100x konsantradan hazırlanan 1x tampon (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) |
| zirkonya/silika boncuklar | Sarf Malzemeleri | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reaktif | Sigma-Aldrich | P6755 | Kuru reaktiften TE tamponu içinde 1x süspansiyon olarak hazırlanan %1 w/v polivinilpolipirolidon |
| Zootermopsis nevadensis | Hayvan | Termitler | ||
| SDS | Reaktif | Sigma-Aldrich | L4390 | Kuru reaktiften suda hazırlanmış %20 sodyum dodesil sülfat çözeltisi |
| Fenol | Reaktif | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-doymuş, ~%73 |
| MiniBeadbeater-8 | Araç | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Tamponlu Tuz Çözeltisi, pH 7.2 | Litre başına formülasyon: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl ve 10 mL 1 M NaHCO3 çözeltisi | ||
| AxioPlan-2 | Mikroskop | Carl Zeiss, Inc. | 40x objektif, 1.6x optivar ve 10x oküler lenslerle donatılmıştır. Örnekler faz kontrast aydınlatma kullanılarak incelenmiştir |
Kaynaklar
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
