$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Sarasija ve Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Nematod popülasyonunun büyümesi ve senkronizasyonu
Bu hayvanlar ~42 saat sonra L4 larva aşamasına ulaşacaktır. Bu sırada, L4 larvalarını, döl üretmelerini önlemek için 0.5 mg / mL 5-floro-2'-deoksiüridin (FUdR) içeren OP50 tohumlu NGM plakalarına bir platin toplama kullanarak taşıyın.
NOTE Bir deney içinde tüm suşların benzer bir süre boyunca senkronize edildiğinden emin olun. FUdR tedavisi hayvanları sterilize eder ve OCR'yi etkileyebilecek yumurtlama ve döl üretimini önler. Bu sterilize edilmiş hayvanlar ertesi gün (1. gün, yetişkin hayvanlar ~ 66 saatte) test için analiz edilecektir. FUdR'nin bazı mutant solucanların fizyolojisini ve ömrünü etkilediği bildirilmiştir. Bu nedenle, ilaç sterilizasyon için kullanıldığında bu dikkate alınmalıdır. Solucanlar ayrıca fem-1 (hc17) veya fem-3 (e2006) gibi dişileştirici mutasyonlar yoluyla sterilize edilebilir. Bununla birlikte, bu mutasyonlar mitokondriyal fonksiyonu etkileyebilir.
- İstenen genetik geçmişe sahip L4 larvalarını (örneğin, N2 [yabani tip] ve sel-12 hayvanları) nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına aktarın (tarif için Tablo 1'e bakınız) Escherichia coli (OP50) ile taze tohumlanmış. Her gerinim için en az iki adet 100 mm veya üç adet 60 mm plaka kullanın. Solucanları uygun büyüme sıcaklığında (15-25 ° C arasında) 3-4 gün boyunca veya plakalar çok sayıda yumurta ve gravid solucanı ile konsantre olana kadar kuluçkaya yatırın.
- Her 100 mm'lik nematod plakası başına yaklaşık 6 mL M9 tamponu (tarif için Tablo 1'e bakınız) kullanarak yumurtaları ve solucanları plakalardan yıkayın ve bunları cam Pasteur pipetleri ile her suş için ayrı 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın. Bu tüpleri 3 dakika boyunca 6.180 x g'da döndürün ve sadece hayvanları ve yumurta peletini koruyarak M9 tamponunu aspire edin.
- Her tüpe 3-4 mL çamaşır suyu çözeltisi ekleyin (tarif için Tablo 1'e bakın) ve aralıklı olarak 6 dakika girdap yapın. Her tüpü doldurmak için M9 tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca 6.180 x g'da döndürün ve süpernatanı aspire edin. Bu yıkamayı M9 ile üç kez tekrarlayın ve yumurta peletini yaklaşık 9 mL M9 tamponu içeren 15 mL'lik taze bir tüpe taşıyın.
- Yumurtadan yeni çıkmış solucanları 20 ° C'de 16-48 saat boyunca nütasyon yaparak senkronize edin. Bu tüpleri 1,5 dakika boyunca 6.180 x g'da döndürün ve senkronize L1 hayvanlarını, OP50'lik bir çim (100 mm plaka başına yaklaşık 6.000-10.000 hayvan) ile taze tohumlanmış ayrı NGM plakalarına koyun ve 20 ° C'de tutun.