Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Abstract

Kaynak: Koemans, T. S., et al. Öğrenme ve Hafızanın Bir Ölçüsü Olarak Drosophila Kur Yapma Koşullandırması. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, Drosophila’da öğrenme ve hafızayı test eden ve kur yapma koşullandırması adı verilen klasik bir koşullandırma testi açıklanmaktadır. Tahlil, alıcı olmayan prematize edilmiş bir kadın tarafından reddedildikten sonra erkek flörtünün azaltılmasına dayanır. Örnek protokol, kısa ve uzun süreli belleği değerlendirmek için kullanılabilecek yordam için bir kurulum gösterir.

Protocol

Bu protokol, Koemans ve diğerleri, Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOT: Aşağıda özetlenen protokolde, toplama, eğitim ve testin bir kopyası açıklanmıştır. Sonuçların tekrarlanabilirliğini test etmek için, bu adımlar paralel olarak, birden fazla günde ve ayrı sinek gruplarıyla tekrarlanmalıdır (Tablo 1). Protokol, yumurtadan yetişkine kadar 10 günlük bir yaşam döngüsüne dayanmaktadır ve bu, 25 °C, %70 nem ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü sabit koşulları altında sinek yetiştirirken normaldir. Bu protokolün tüm yönleri, koşulların tüm tahlil boyunca sabit tutulduğunu varsayar. Süreler, araştırmacının günün tercih ettiği saate bağlı olarak uygun şekilde ayarlanabileceğinden, inkübatörde ışıklar açılmadan önceki (BLO) veya ışıklar açıldıktan sonraki (ALO) saatler olarak gösterilir. CO₂ gazını sadece saf erkek sineklerin ilk toplanması ve prematize dişilerin toplanması için kullanın. Kur yapma koşullandırması için bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur:

1. Premated kadın koleksiyon kültürlerinin oluşturulması
2. Erkek deneklerin toplanması için kültürlerin oluşturulması
3. Konut bloklarının hazırlanması
4. Standartlaştırılmış premate dişilerin üretimi için çiftleşme şişelerinin kurulması
5. Erkek deneklerin toplanması
6. antrenman
7. test etme
8. Video veri analizi ve istatistik

1. Premated Kadın Koleksiyon Kültürlerinin Oluşturulması

1. Powerfood hazırlayın. % 0.8 (a / h) agar,% 8 (a / h) maya,% 2 (a / h) maya özütü,% 2 (a / h) pepton,% 3 (a / h) sükroz,% 6 (a / h) glikoz,% 0.05 (a / h)_MgS04 ve% 0.05 (a / h) CaCl_2’yi 15 dakika suda kaynatın. % 0.05 (a / h) metilparaben (DİKKAT: toksik) ve% 0.5 (h / h) propiyonik asit (DİKKAT: toksik) eklemeden önce çözeltinin 70 ° C’ye soğumasını bekleyin. Homojen bir çözelti elde etmek için 50 °C’ye kadar soğuturken karıştırarak iyice karıştırın.
2. Yiyecekler oda sıcaklığında katılaşmadan önce, her 175 mL plastik şişeye ~ 50 mL güç gıdası ekleyin. Yiyeceklerin daha fazla soğumasını bekleyin. Şişeyi bir tapa ile kapatın.
   NOT: Powerfood, muhtemelen yumurtlamayı indükleyerek çok sayıda sinek üretimi için özel olarak formüle edilmiş özel bir gıda karışımıdır. Powerfood, davranış analizi için kullanılacak erkek sinekleri üretmek için kullanılmaz (2. adım), çünkü atipik diyet ve potansiyel kalabalık gelişimi etkileyebilir.
3. -11. günde (Tablo 1), powerfood şişelerinde yaklaşık 60-100 sinek (erkek ve dişi karışımı) ile 5-20 vahşi tip kültüre başlayın; Bunlar, standartlaştırılmış premated dişiler üretmek için adım 4’te kullanılacaktır. Larvaların pupa olabileceği alanı artırmak için her şişeye bir filtre kağıdı ekleyin; Bu, kapanabilecek sinek sayısını artıracaktır.
4. “Standartlaştırılmış prematlaştırılmış dişilerin üretimi için çiftleşme şişelerinin oluşturulması” (adım 4) için girdi olarak yeterli sayıda yeni kapanan sinek elde etmek için deney boyunca 1.1-1.3 adımlarını periyodik olarak tekrarlayın.

2. Erkek deneklerin toplanması için kültürlerin oluşturulması

1. Adım 1.1 ve 1.2’de açıklandığı gibi suda %0,5 (a/h) agar, %2,75 (a/h) maya, %5,2 (a/h) mısır unu, %11 (a/h) şeker, %0,05 (a/h) metilparaben ve %0,5 (h/h) propiyonik asit ile yapılan normal yiyecekleri hazırlayın. 175 mL’lik plastik şişeleri bir şişe tapasıyla kapatın.
2. -10. günde (Tablo 1), normal gıda içeren her 175 mL şişeye yaklaşık 10-20 erkek ve yaklaşık 30-75 bakire dişi (Malzemeler / Ekipman Tablosu) yerleştirin. Pupa için yüzey alanını artırmak ve üretkenliği en üst düzeye çıkarmak için bir filtre kağıdı ekleyin.
3. Gerekli sayıda denek erkeği elde etmek için genotip başına üç ila altı adet 175 mL flakon oluşturun.
   NOT: İstenen genotipin verimliliğine bağlı olarak daha fazla flakona ihtiyaç duyulabilir.

3. Konut Bloklarının Hazırlanması (Şekil 2A)

1. Bir mikrodalgada muhafaza bloğu başına yaklaşık 50 mL güç gıdasını eritin veya taze olarak hazırlayın.
2. Çok dağıtıcılı bir pipet kullanarak 96 oyuklu, düz tabanlı bir bloğun her bir kuyucuğuna 500 μL güç gıdası ekleyin.
3. Yiyeceklerin oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
4. Blokları PCR yapışkan film ile örtün ve sineklere temiz hava sağlamak için kuyu başına en az 4 delik açmak için bir iğne kullanın.
5. Her bir kuyuyu açabilmek için, yapışkan filmi her sıra arasında uzunlamasına kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Filmi bloğun bir ucunda olduğu gibi bırakın.
6. Bloklar 4 °C’de 2 güne kadar saklanabilir.
   NOT: Kullanmadan önce blokların oda sıcaklığına yeniden dengelenmesini bekleyin.

4. Standardize Edilmiş Premated Dişilerin Üretimi için Çiftleşme Şişelerinin Kurulması

1. -1. günde, 2-5 saat BLO’da önceden çiftleştirilmiş dişi toplama kültürlerinden tüm yetişkin yaban tipi sinekleri çıkarın ve atın.
2. Aspiratörü (Şekil 2B) kullanarak bu şişelerden 2 ila 3 saatlik aralıklarla (örneğin, 30 dakika, 2,5 saat ve 5 saat ALO’da) sinekleri toplayın ve bunları az miktarda maya macunu ve filtre kağıdı ile desteklenmiş yeni bir güç gıda şişesine yerleştirin.
3. Kalabalıklaşmayı önlemek ve en uygun çiftleşme atmosferini teşvik etmek için, her yeni şişeye 150-200’den fazla sinek aktarmayın. En az% 25 erkek sağlayarak tüm dişilerin çiftleşmesini sağlayın. Deneyin boyutuna uyum sağlamak için çiftleşme şişelerinde yeterli dişinin bulunduğundan emin olun.
   NOT: Bu, protokolde çok önemli bir adım olduğundan, yeni çiftleşme şişesine yalnızca yeni kapatılmış sineklerin ve eski sineklerin, larvaların veya pupaların aktarılmadığından emin olun.
4. Tüm dişilerin çiftleşmesi için yeterli zaman tanımak için bu “çiftleşme şişelerini” dört gün boyunca kuluçkaya yatırın.

5. Erkek Deneklerin Toplanması

1. 1. günde (Tablo 1) 2-3 saat BLO’da, tüm yetişkin sinekleri erkek toplama şişelerinden çıkarmak için CO₂ kullanın (adım 2), ancak önümüzdeki birkaç saat içinde daha fazla sineğin kapanmasına izin verin.
2. Sonraki 5-6 saat boyunca, her 20-30 dakikada bir CO₂ kullanarak yeni kapatılan sinekleri çıkarın ve her bir erkeği aspiratörü kullanarak (Şekil 2 B) yuva bloğunun ayrı bir kuyusuna koyun (adım 3).
3. Kuyuyu yapışkan PCR filmi ile yeniden kapatın.
   NOT: Bu, protokolde çok önemli bir adımdır. Erkekler sık sık toplanmalıdır. Toplanan erkekler, soluk pigmentasyon ve yarı saydam karın bölgesinde mekonyum varlığı gösterdiklerinde, eklosiyon zamanına yakın bir yerde konut bloğunda izole edilmelidir.
   NOT: Aspiratörün nazik kullanımı sineklerin transferine izin verir; bununla birlikte, uygunsuz kullanım sinekleri strese sokacak ve tahlilde varyansa neden olacaktır (Tartışmaya bakınız).
4. Genotip başına 48 erkeğe kadar toplamayı hedefleyin. Bu, hem saf hem de eğitimli koşulların analizi için gereken maksimum erkek sayısına küçük bir fazlalık sağlar ve daha sonraki transfer adımlarında bir miktar kayba izin verir.

6. Eğitim

1. CO₂ kullanarak sinekleri çiftleşme şişesinden çıkarın (adım 4.2) ve önceden doğmuş dişileri erkeklerden ayırın.
2. Aspiratörü kullanarak, yeni bir yuva bloğunun bir sırasındaki her bir oyuğa tek bir anestezi uygulanmış, önceden matlaştırılmış dişi ekleyin.
3. Aspiratörü kullanarak ve anestezi olmadan, adım 5.2’de kurulan yuva bloğundan bireysel bir saf erkeği önceden doğmuş bir dişi içeren kuyuya aktarın. Erkek kuyuya yerleştirildikten sonra, yapışkan film ile hemen tekrar kapatın; Erkeğin kaçmasına izin vermeyin.
   NOT: Erkek sinekleri, doğal “negatif jeotaksi” davranışlarından yararlanarak aspiratörden konut bloğuna aktarın.
4. Yeterli erkek-dişi çifti oluşana kadar 6.2-6.3 adımlarını tekrarlayın. İdeal olarak, genotip başına iki tam sıra bir konut bloğu olmak üzere 24 çift oluşturun. Kalan saf erkekleri adım 5.2’de kurulan orijinal konut bloğunda bırakın.
5. Eğitim süresi boyunca erkek-kadın çiftlerini rahatsız etmeyin (Tablo 2, Şekil 1B).
   NOT: Bu süre zarfında, erkek mahkemeye çıkacak ve premate dişi tarafından reddedilecektir. Öğrenme ve STM için eğitim süresi 1 saat, LTM için eğitim süresi 7-9 saattir.
6. Eğitimi sonlandırın (Tablo 2, Şekil 1B) erkeği prematize edilmiş dişiden nazikçe ayırmak için bir aspiratör kullanarak; anestezi kullanmayın. Ayrılan erkeği yeni bir konut bloğuna yerleştirin.
7. Tüm saf erkekleri nazikçe ve anestezi olmadan adım 5.2’de kurulan konut bloğundan yeni bir konut bloğuna aktarmak için aspiratörü kullanın.
   NOT: Bu adım STM ve öğrenme için isteğe bağlıdır, ancak LTM için çok önemlidir çünkü sinekler LTM’yi test etmek için 24 saat daha barındırılır.
8. STM ve LTM için, testten önce (adım 7) erkeklerin sırasıyla 1 saat ve ~24 saat dinlenmesine izin verin (Tablo 2, Şekil 1B).
9. Öğrenmek için hemen eğitimli ve saf erkekleri test edin (7. adım).

7. Test etme

1. CO₂ kullanarak çiftleşme şişelerinden sinekleri toplayın (adım 4.2) ve önceden doğmuş dişileri erkeklerden ayırın.
2. Dişilerin normal yiyecek içeren bir şişede en az 1 saat anesteziden sonra iyileşmesine izin verin.
3. Test başlamadan önce tüm ekipmanın hazır olması için video kayıt cihazlarını önceden monte edin (Şekil 2C).
4. Öğrenme, STM ve LTM için farklı zaman çizelgelerine göre testi başlatın (Tablo 2, Şekil 1B). Öğrenme için eğitimden hemen sonra, STM için eğitimden 1 saat sonra ve LTM için eğitimden 24 saat sonra test yapın.
5. Aspiratörü kullanarak, tek bir erkeği dinlenme konut bloğundan veya öğrenme test ediliyorsa eğitim konut bloğundan (adım 6.7, eğitilmiş; adım 6.8, saf) bölücü kapalıyken bir kur sahasının yarısına nazikçe aktarın (Şekil 2D; bir bina planı için Dosya S1’e bakın).
   NOT: Doğal “negatif jeotaksi” davranışının kullanılması, erkek sinekleri aspiratörden kur alanına aktarmak için yeterli olmalıdır.
6. Giriş deliğini hızlı ama nazikçe bir sonraki arenaya taşıyın ve 18 arenanın tamamında bir erkek olana kadar 7.5 adımını tekrarlayın.
7. Aspiratörü kullanarak ve CO₂ olmadan, 18 arenanın diğer yarısına önceden doğmuş bir dişi (adım 7.2’de toplanmıştır) ekleyin.
8. Kur yapma odasını, kuyuların açıklığı aşağı bakacak şekilde dikkatlice kameranın altına yerleştirin (Şekil 2C).
9. Erkekler ve premate dişiler arasında doğrudan etkileşime izin vermek için arenaların bölücüsünü çıkarın.
10. Davranışı hemen en az 10 dk.
    boyunca kaydetmeye başlayın NOT: İki kameralı bir kurulum kullanırken, verimliliği en üst düzeye çıkarmak için iki kur plakasının paralel kaydı, çakışan zaman dilimlerinde yapılabilir.
11. Elde tutulan bir elektrikli süpürge kullanarak kur yapma alanlarını boşaltın ve yeniden kullanmadan önce kur odasının havalandırılmasına izin verin.
12. Tüm genotiplerin ve koşulların (yani saf ve eğitimli) testi tamamlanana kadar 7.4-7.11 adımını tekrarlayın.

8. Video Veri Analizi ve İstatistik

1. Her bir erkek sinek için test süresinin ilk 10 dakikasında erkeğin mahkemeye çıktığı sürenin yüzdesi olarak tanımlanan kur yapma indeksini (CI) hesaplayın.
   NOT: Bu, basmakalıp kur yapma davranışını gözlemleyerek (Şekil 1A) veya kur yapma davranışının otomatik olarak ölçülmesi için bilgisayar yazılımı kullanılarak manuel olarak yapılabilir.
   NOT: Yeterli istatistiksel güç elde etmek ve CI verilerinin tutarlılığını değerlendirmek için üç gün boyunca koşul başına 40-60 erkeğin analiz edilmesi önerilir.
2. Saf erkeklere kıyasla eğitimli erkeklerin ortalama CI’sindeki azalma yüzdesi olarak tanımlanan öğrenme indeksini (LI) hesaplayın (LI = (CI_naif – CI_eğitimli) / CI_naif). Testin her günü için LI’yi değerlendirin ve tüm test günlerinin toplamından hesaplanan kümülatif LI ile karşılaştırın.
3. Headers.
   olarak “Genotype” ve “CI” ile ayrı bir iki sütunlu sekme veri dosyası oluşturun NOT: Bu başlıklar büyük/küçük harfe duyarlıdır. Her CI için genotipin adı, genotipin bir tanımından ve ardından bir alt çizgi ve eğitim koşulundan oluşmalıdır (örneğin, genotype_N ve genotype_LTM, vb., burada N = naif ve LTM = uzun süreli bellek; bir örnek için Ek Dosya S2’ye bakın). Bu ek açıklama önemlidir, çünkü analearn işlevi, “Genotip” sütunundaki ilk alt çizgiden sonra bulunan karakterlere dayalı olarak eğitimli ve saf sinekleri tanımlayacaktır.
4. Farklı genotiplerden LI değerleri arasındaki farkların istatistiksel anlamlılığını değerlendirmek için bir randomizasyon testi gerçekleştirmek için analearn R betiğini (Ek Dosya S3) kullanın.
   1. Betiği (Ek Dosya S3) R’ye kaynaklayın ve bu da “analearn”
      adlı bir işlevi tanımlar. NOT: Fonksiyon tanımı şöyledir: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. R komut satırına “analearn()” girerek ve açılır pencere aracılığıyla analiz edilecek veri dosyasını (adım 8.3’te üretilen) seçerek işlevi başlatın.
   3. İlgili numarayı girerek ve enter tuşuna basarak kontrol genotipi olan referans mutasyonu seçin.
      NOT: Referans genotipi seçtikten sonra, komut dosyasının 10.000 önyükleme çoğaltması gerçekleştirmesi birkaç saniye sürer.
   4. Genotipi, öğrenme koşulunu (yani, öğrenme, STM veya LTM), ortalama CI naif, ortalama CI eğitilmiş, LI, deneysel koşula kıyasla kontrolün LI’si arasındaki farkı içeren çıktı tablosunu (Tablo 3) gözlemleyin (LI dif), LI dif’in %95 güven aralığının alt sınırı (LL) ve üst limiti (UL), ve anlamlı bir fark olmama olasılığını gösteren p değeri.
      NOT: analearn, veri dosyasının bulunduğu dizinde bir çıktı metin dosyası saklayacaktır. Ancak, çıkış tablosu R-Studio konsolunda da görünür. Varsayılan ad, sağlanan veri dosyasının adına göre oluşturulur.
   5. Analearn işlevinde, bootstrapping.
      parametrelerini ayarlamak için işlevin varsayılan ayarlarını değiştirmek için kullanılabilecek birkaç bağımsız değişken vardır. NOT: “nboot”, önyükleme çoğaltmalarının sayısını tanımlar ve varsayılan olarak 10.000 olarak ayarlanır. Bu değer, sıfırdan büyük herhangi bir tamsayı sayısına dönüştürülebilir. Tablo 5, işlevin varsayılan ayarlarını değiştirmek için kullanılabilecek birkaç bağımsız değişkeni listeler. Ancak, düşük sayıda önyükleme çoğaltmasıyla üretilen verilerin kullanılması önerilmez.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–