Drosophila Oyuk Açma ve Tünel Açma Deneyi: Sinek Larvalarında Doku Hipoksisini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu protokol, Qiang ve ark., Drosophila melanogaster Larvae'de Hipoksi Tespiti için Bir Oyuk Açma/Tünelleme Testi, J. Vis. Exp. (2018).

>1. Larvaların hazırlanması

1. Tahlilin başlamasından iki veya daha fazla gün önce, Wieschaus ve Nusslein-Volhard tarafından tarif edildiği gibi yumurtlama kaplarında istenen deney ve kontrol kombinasyonlarının (her biri en az 20 dişi ve 10 erkek) çaprazlamalarını ayarlayın, ancak 50 mL polipropilen beherler ve 6.0 cm tek kullanımlık Petri kapları kullanarak üzüm agar içeren ve kullanımdan hemen önce maya ezmesi ile bulaşmış. Sinekleri yumurta tabaklarında ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında karanlıkta tutun.
2. Üzüm agar tarifi – 100 mL dondurulmuş, %100 üzüm suyu konsantresi, 350 mL deiyonize su, 5 mL buzlu asetik ve 13 g D. melanogaster agar'ı 1 L'lik bir cam beherde birleştirin. 1-2 dakikalık patlamalar halinde mikrodalga, agar tamamen eriyene kadar patlamalar arasında karıştırın. Çözeltiyi birkaç dakika soğutun, ardından %95 etanol içinde 10 mL %10 (a/h) Nipagen (metil-p-hidroksibenzoat) ekleyin. Karıştırın, ardından tek kullanımlık 6,0 cm'lik Petri kaplarına tabak başına 7 mL pipetleyin, jelleşmeye ve oda sıcaklığında 3-4 saat kurumaya bırakın. 4 °C'de plastik torbalarda saklayın.
3. Maya ezmesi tarifi – 7 gr kuru maya, 10 mL deiyonize su, homojen kıvam alana kadar bir spatula ile karıştırın.
4. Deneysel ve kontrol larvaları oluşturmak için zamanlanmış yumurta toplamaları. Yeni, maya bulaşmış üzüm tabakları kullanarak, sabah saatlerinde karanlıkta 4 saat boyunca oda sıcaklığında yumurtaları toplayın. Bu 4 saatlik toplama plakalarını çıkarın ve yeni plakalarla değiştirin. 4 saatlik toplama plakalarını, larvaların çoğunun yumurtadan çıkacağı ertesi gün öğleden sonraya kadar 25 ° C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın. Bu ilk instar larvalarını toplayın ve deneyi kurmak için kullanın.

2. Tahlil plakalarının ayarlanması

1. Tahlil plakalarının hazırlanması. Tahlilin tek bir çalışması için, her biri 10 deneysel larvadan oluşan beş tahlil plakası ve 10 kontrol larvasından oluşan beş tabak hazırlayın. Her plakadan merkezi bir agar çekirdeğini çıkarmak için 1,5 cm'lik bir mantar delici kullanın ve yiyecek için bir delik oluşturun. Maya macununu (0,8 - 0,9 g) deliğe koyun ve deliği dolduran bir höyük yapmak için bir spatula ile hafifçe vurun.
2. Agar plakası hazırlama - 700 mL deiyonize suyu 16 g D. melanogaster agar ile 2 L'lik bir cam beherde birleştirin ve mikrodalgada 5 dakika pişirin. Mikrodalgadan çıkarın ve çözünmemiş agarı çözeltiye getirmek için bir cam çubukla karıştırın. % 95 etanol içinde 17.5 mL% 10 (a / h) Nipagen ekleyin, karıştırın, ardından 30 saniyelik patlamalarla mikrodalga ısıtmaya devam edin ve ardından tüm agar tamamen eriyene kadar karıştırın. Bir veya iki dakika soğutun, ardından 15 mL alikotları 10 cm'lik plastik Petri kaplarına pipetleyin. Agarın jelleşmesine izin verin, plakaları kapaklarla kapatın ve birkaç saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Plakaları kapalı plastik torbalarda 18 °C.
   sıcaklıkta saklayın NOT 1: Aşırı kurumaya bağlı olarak plakaların yüzeyinde Nipagen kristallerinin oluşmasını önlemek için, plakaları hazırlandıktan sonraki birkaç gün içinde kullanın. Gerekirse, kristaller üzerlerine birkaç mikrolitre %95 alkol damlatılarak yeniden çözülebilir.
   NOT 2: agar grupları farklı jelleşme özelliklerine sahip olabilir. Kuru jel plakalar dokunulduğunda sağlam olmalı ve yiyecek deliğini oluşturmak için mantar delici kullanılırken temiz, sağlam bir agar çemberinin çıkarılabilmesi için yeterince esnek olmalıdır (yukarıya bakın).
3. Larvaların tahlil plakalarına yerleştirilmesi. Plastik bir mikrospatulanın ucunu kıvırmak için mekanik basınç kullanın ve larvaları toplamak için "yapıştırıcı" sağlamak için ucu maya macununa batırın. İlk instar larvalarını tek tek toplayın ve onları yiyecek höyüğüne yakın agar tabağına yerleştirin. Hem deneysel hem de kontrol genotipleri için 10 larvadan oluşan en az beş kopya plaka hazırlayın. Tamamlandığında, her bir plakayı kapatın ve etiketleyin ve plakaları (kapak tarafı yukarı bakacak şekilde) oda sıcaklığında karanlık bir alana yerleştirin (laboratuvarımızda bu 22 °C'dir).

3. Test plakalarının izlenmesi

1. Plakaları günlük olarak diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve larva sayısını yiyeceğin üstüne veya agar yüzeyine kaydedin. Görünür ölü veya ölmekte olan larvaları not edin. Larvalar üçüncü instara hareket ederken agar substratumuna tünel açmanın ne zaman ve ne zaman görüldüğünü not edin. Pupaların oluşmaya başladığı tarihleri not edin ve herhangi bir pupa anormalliğini not edin. Tüm larvalar ölene veya pupa olana kadar günlük gözlemlere devam edin.
2. Pupaları bükülmüş bir alay iğnesi ile plakadan dikkatlice çıkarın ve bir üzüm tabağına aktarın. İstenirse, kaç tanesinin yetişkin olarak kapandığını belirlemek için pupaları izlemeye devam edin.