Drosophila Larva Hayali Disk Diseksiyonu: Gelişmekte Olan Epiteli Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Morimoto, K. ve Tamori, Y. Drosophila Imaginal Disk Epitelinde Tümörlerin İndüksiyonu ve Teşhisi. J. Vis. Uzm. (2017).

Drosophila hayali diskleri boyanırken, genellikle disklerin açıkta kaldığı ancak vücuda bağlı kaldığı kaba bir diseksiyon yapılır. Lekelendikten sonra, ilgilenilen diskler izole edilir ve monte edilir. Örnek protokol, kanat hayali disk diseksiyonu ve montajı için bir prosedürü göstermektedir.

Protokol

Bu protokol, Morimoto ve Tamori, Drosophila Imaginal Disc Epithelia'da Tümörlerin İndüksiyonu ve Teşhisi, J. Vis. Exp. (2017).

1. Larvaların Diseksiyonu

1. Tahta bir çubuk veya künt forseps ile dolaşan üçüncü instar larvalarını toplayın, bunları bir floresan stereoskopik mikroskop altında uygun floresan belirteçlerle (örneğin, EGFP) genotipleyin ve PBS (fosfat tamponlu salin) içeren bir diseksiyon kabına yerleştirin.
2. Larvaları PBS'de 2 mL plastik transfer pipetleri ile pipetleyerek yıkayın.
3. Larvaların merkezini bir forseps ile sıkıştırın ve diğer forseps ile vücudu ikiye bölün.
4. Vücudu ters çevirmek için ön yarının ağız kancasını bir forseps ile sıkıştırın ve diğer forseps ile ağzı vücuda doğru itin.
5. Tükürük bezleri veya yağ cisimleri gibi gereksiz malzemeleri forseps ile çıkarın.

2. Fiksasyon ve Antikor Boyama

1. Larva gövdesinin disseke edilmiş ön yarısını (hayali kanat diskleri dahil) 1,5 mL'lik bir plastik tüpe aktarın ve 1 mL Fix solüsyonunda (PBS'de %4 Formaldehit) karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafif bir rotasyonla sabitleyin.
   Dikkat: Formaldehit toksiktir ve kanserojen potansiyele sahiptir. Cilt temasını önlemek için koruyucu eldiven ve giysi giyin.
   NOT: Bu bölümde, aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar karanlıkta oda sıcaklığında bir nutatör üzerinde gerçekleşir.
2. Düzeltme solüsyonunu çıkarın ve atın. Dokuları 1 mL PBT (PBS'de% 0.3 Triton X-100) ile her biri 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
3. PBT'yi çıkarın ve bloke etmek için 1 mL PBTG (PBT'de %0.2 sığır serum albümini ve %5 normal keçi serumu) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de nutat ekleyin.
4. PBTG'yi çıkarın ve PBTG ile uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor çözeltisini ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca 4 °C'de nutat yapın.
5. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile her biri 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
6. PBT'yi çıkarın ve PBTG (1:400) ile uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de nutat.
7. İkincil antikor solüsyonunu çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile her biri 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
8. F-aktini lekelemek için PBT'yi çıkarın ve PBS'de uygun şekilde seyreltilmiş Phalloidin solüsyonu ekleyin (1:40). Daha sonra 20 dakika nutate yapın. Phalloidin solüsyonunu çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile her biri 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
9. Nükleer DNA'yı lekelemek için PBT'yi çıkarın ve DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi (PBS'de 0.5 μg / mL DAPI) ekleyin. Sonra 10 dk.
   nutate Dikkat: DAPI kanserojen potansiyele sahiptir. Cilt temasını önlemek için koruyucu eldiven ve giysi giyin.
10. DAPI solüsyonunu çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile her biri 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
11. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1 mL PBS'de bir kez durulayın.
12. PBS'yi çıkarın ve ön montaj ortamı olarak 500 μL %100 gliserol ekleyin.

>3. Mikroskop Slaytlarına Montaj

1. Lekeli dokuları 2 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak bir mikroskop lamına yerleştirin.
2. Dokuları forseps ile başka bir mikroskop lamı üzerinde montaj ortamı damlalarına aktarın.
3. Bir forseps ile diseke dokunun ucunu tutun ve diğer forseps ile beyin ve göz anten disklerini çekin.
   NOT: Parçalara ayrılmış beyinleri, kanat hayal disklerinin yakınına yerleştirmek için saklayın. Beyinler, lamel in kanat hayal disklerini ezmesini önleyen bir platform görevi görür.
4. Kanat hayali diskleri izole etmek için, diseke edilen dokunun ucunu bir forseps ile tutun ve vücut duvarını nazikçe çizin ve diğer forseps ile diskleri yırtın.
   NOT: Kanat hayali diskleri bulmak zorsa, trakeayı arkadan ön tarafa doğru soyun. Kanat hayali diskler soluk borusuna yapışır.
5. Hayali diskleri nazikçe bir lamel ile örtün ve oje ile kapatın; 4 ° C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Wako (Vahşi)	162-19321
TritonX-100	Wako (Vahşi)	168-11805
Formaldehit	Wako (Vahşi)	064-00406
sığır serum albümini	Sigma	A7906
normal keçi serumu	Sigma	G6767
montaj ortamı, Vectashield	Vektör Laboratuvarları	H-1000
DAPI (DAPI	Sigma	D9542
fare anti-Dlg 4F3	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	4F3 anti-diskler büyük, RRID: AB_528203	PBTG'de seyreltin, 1:40
fare anti-MMP1	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	3A6B4, RRID:AB_579780	3 1:1:1 oranında karıştırılır ve PBTG'de seyreltilir, 1:40
fare anti-MMP1	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	3B8D12, RRID:AB_579781	3 1:1:1 oranında karıştırılır ve PBTG'de seyreltilir, 1:40
fare anti-MMP1	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	5H7B11, RRID:AB_579779	3 1:1:1 oranında karıştırılır ve PBTG'de seyreltilir, 1:40
fare-anti-atubulin	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	AA4.3, RRID:AB_579793	PBTG'de seyreltin, 1:100
Alexa Flor 546 Phalloidin	Moleküler problar	A22283 (İngilizce	PBS'de seyreltin, 1:40
keçi anti-fare IgG antikoru, Alexa Fluor 546	Moleküler problar	A11030	PBTG'de seyreltin, 1:400
Sinek suşları
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#8609	UAS-EGFP ile yeniden birleştirildi
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#26796	UAS-EGFP ile yeniden birleştirildi
UAS-lgl-RNAi	Viyana Drosophila RNAi merkezi	#51247
UAS-yazı-RNAi	Viyana Drosophila RNAi merkezi	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#6
Act>CD2>GAL4 (dışa çevrilebilir GAL4)	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#4780	UAS-EGFP ile yeniden birleştirildi
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#5428	X kromozomu
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#6658	Üçüncü kromozom
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#24650	ikinci kromozom
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	#24651	Üçüncü kromozom
vkg-GFP	Morin ve ark. 2001		GFP protein tuzağı