Bu protokol, Immarigeon ve ark., Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin İkincil Hücrelerinden RNA'yı İzole Etmek İçin FACS Tabanlı Bir Protokol, J. Vis. Exp. (2019).
1. Çözeltiler ve Malzeme Hazırlama
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- Serum Takviyeli Ortam (SSM) Hazırlayın: Schneider'in Drosophila ortamı% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile tamamlandı.
- 1x tripsin enziminin (örneğin, TrypLE Express Enzimi) alikotlarını hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
- Papain [50 U / mL] alikotlarını hazırlayın (-20 ° C'de saklanır ve sadece bir kez çözülür).
- 1x fosfat tampon salin (PBS, oda sıcaklığında saklanır) hazırlayın.
- Aksesuar bezlerinin fiziksel olarak ayrılması için birden fazla alev yuvarlatılmış pipet ucu hazırlayın.
NOT: İşlenmemiş plastiğe yapışma eğiliminde olduklarından, aksesuar rakorlarını tutmak için düşük tutma uçları kullanın. Alev yuvarlama işlemi, uç açıklığını azaltır ve ucun kenarlarını düzleştirir. Bu, hücre zarlarını kesmeden peptidaz sindiriminden sonra verimli bir ayrışma sağlar.
- Keskin bir bıçakla 200 μL'lik bir ucu kesin ve ucunu yuvarlamak için yavaşça bir alevin üzerinden geçirin, böylece açıklık adım 2.7'de kullanım için daha geniş ancak pürüzsüz olur.
- Birden fazla 1.000 μL'lik ucun açıklığını, uç açıklığını bir alevin yanından bir saniyeden daha kısa bir süre geçirerek daraltın. Aşırı erimeyi veya tıkanmayı önlemek için ucu hafifçe döndürün. Yapılan uçları dardan genişe doğru sıralayın. Bu, aspirasyon hızını zamanlayarak yapılabilir. En dar uçların verimliliğini test etmek için küçük ölçekli bir AG örneğini ayırmaya çalışın.
NOT: Bu uçlar mekanik çalkalama için kritik öneme sahiptir. Kaliteli alev yuvarlatılmış pipet uçları, hücre canlılığını korurken tam ayrışmaya izin verir. Bu nedenle, bu uçlar yeniden kullanım için prosedürün sonunda su ile iyice yıkanır. Bu, günden güne tekrarlanabilir ayrışmaya izin verir.
2. Aksesuar Bezlerinin Diseksiyonu
- 20 ila 25 erkek Drosophila'yı buz üzerinde bir cam tabağa koyun.
- SSM'de 1 erkeği diseksiyon edin. Üreme kanalını çıkarın ve aksesuar bez çiftini boşalma kanalı dışındaki diğer tüm dokulardan temizleyin.
NOT: Testisleri çıkarın, çünkü serbest bırakılan sperm topaklar oluşturabilir ve ayrışma sürecini bozabilir. Yüzerken kullanımı zorlaştıran boşalma ampulünü çıkarın.
- Forseps ile aksesuar bezlerini oda sıcaklığında SSM ile doldurulmuş bir cam plakaya aktarın. SSM'de 20 çift bezden oluşan bir parti elde etmek için 2.2.2.3 adımlarını 20 kez tekrarlayın.
NOT: Bu adımlar 15 ila 20 dakika içinde gerçekleştirilecektir. AG'ler sağlıklı görünmeli ve bezlerin etrafındaki kas tabakasının peristaltik hareketleri görünür olmalıdır. GFP, bir floresan mikroskobu kullanılarak izlenebilir.
- Oda sıcaklığında 1-2 dakikalık bir yıkama için aksesuar rakorlarını 1x PBS'ye aktarın.
NOT: Daha iyi ayrışma için, bezleri PBS ile durulamak zorunludur. Bununla birlikte, hücreler PBS'de stres belirtileri gösterdiğinden bu adımın süresi sınırlı olmalıdır; PBS'deki ayrışmış ikincil hücreler hızla şişer ve ölür.
- Ayrışma çözeltisini elde etmek için 20 μL papain [50 U/mL] 180 μL 1x tripsin enzimine seyreltin (ölçeği büyütmek veya küçültmek için her erkek için 9 μL tripsin enzimi ve 1 μL papain tutun). Forseps ile aksesuar bezlerini bu çözeltiye aktarın.
- Aksesuar bezlerinin ucunu (ikincil hücreler içeren) proksimal kısımdan izole edin. Bir glandüler lobun ortasını sıkıca sıkıştırmak için ince forseps kullanın ve ikinci bir forsepsin keskin ucuyla kesin. Ayrışmayı iyileştirmek ve hücre sıralama süresini azaltmak için aksesuar bezlerinin proksimal kısmını ve boşalma kanalını çıkarın.
NOT: Distal kısmın 20 çift bezden diseke edilmesi 15 ila 20 dakika sürecek ve peptidazlar tarafından sindirim böylece oda sıcaklığında başlayacaktır.
- Tüm bez uçları diseke edildikten sonra, Adım 1.2.1'de hazırlanan özel bir 200 μL pipet ucu kullanarak bunları 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Rakorları tutmadan önce geniş, yuvarlak ve ıslak olmalıdır.
NOT: Aksesuar bez dokusunu pipetlemek için uçlar her zaman uygun solüsyonla önceden ıslatılmalıdır (tripsin enzimi veya SSM, bu amaç için her birinden bir tüp bulundurun). Kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında uçları dikkatlice durulayın.